Instabile Verbindungen: Fehlregulierte COT-1-Kinase-Aktivität und der Verlust des HAM-15-Proteins beeinträchtigen die Koordination pilzlicher Zell-Zell-Interaktionen

Well, Lucas

doi:10.24355/dbbs.084-202602031301-0

Published

Instabile Verbindungen : Fehlregulierte COT-1-Kinase-Aktivität und der Verlust des HAM-15-Proteins beeinträchtigen die Koordination pilzlicher Zell-Zell-Interaktionen

German
English

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Untersuchung der Serin/Threonin-Kinase COT-1 im filamentösen Ascomyceten Neurospora crassa. Frühere Arbeiten basierten auf der temperatur-sensitiven Mutante cot-1. Zur gezielten funktionellen Charakterisierung wurde eine analog-sensitive Variante (COT-1M291A) etabliert, die eine chemisch kontrollierbare Inaktivierung der Kinaseaktivität ermöglicht. So konnten erstmals mikroskopische Analysen von Zellen mit temporär inhibierter COT-1-Aktivität durchgeführt und neue, zeitlich aufgelöste Einblicke in ihre Funktion gewonnen werden. Die Inhibition von COT-1 führte zu stark hyperverzweigtem Wachstum der Hyphen und auskeimenden Konidiosporen sowie zu deutlich reduzierter Zell-Zell-Interaktion im Kontext somatischer Zellfusionen. Im Gegensatz zu klassischen Fusionsmutanten war dieser Prozess jedoch nie vollständig aufgehoben. Untersuchungen fluoreszenzmarkierter Proteine, die die Zell-Zell-Kommunikation vermitteln, zeigten eine häufige Fehllokalisation an den Zellspitzen. Zudem akkumulierten dort Polarisationsmarker wie das Formin BNI-1 und Aktin. Die Beobachtung von GUL-1-abhängigen Stressgranula in Zellen mit reduzierter COT-1-Aktivität deutet darauf hin, dass COT-1 über die Phosphorylierung des mRNA-bindenden Proteins GUL-1 an deren Auflösung beteiligt ist. Eine unzureichende Phosphorylierung könnte die persistierende Bildung von Stressgranula und damit den charakteristischen Wachstumsdefekt verursachen. Darüber hinaus wurde versucht, die Zellwandsensoren WSC-1 und HAM-7 fluoreszenzmikroskopisch zu lokalisieren, da Zellen mit verminderter COT-1-Aktivität eine verdickte Zellwand aufweisen. Obwohl die direkte Visualisierung nicht gelang, ergaben sich funktionelle Hinweise: WSC-1 scheint nicht allein für die Aktivierung der MAP-Kinase MAK-1 verantwortlich zu sein, da MAK-1-GFP selbst im Δwsc-1-Stamm weiterhin an Zellkontaktstellen lokalisiert war. Die Ergebnisse weisen demnach auf alternative Signalwege zur Aktivierung von MAK-1 hin. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde das bislang in N. crassa uncharakterisierte Gen NCU00938 (ham-15) untersucht und seine zentrale Rolle bei der Etablierung einer pilzlichen Kolonie aufgezeigt. Die Deletion dieses Gens führte zu vollständigem Verlust der Zell-Zell-Kommunikation und stark verzögerter Kolonieetablierung. Interessanterweise konnten Δham-15-Keimlinge in seltenen Fällen mit Wildtyp-Zellen fusionieren.

Die gewonnenen Erkenntnisse erweitern das bestehende Arbeitsmodell zur somatischen Zellfusion in N. crassa. Mit HAM-15 wurde ein neuer Faktor der Zell-Zell-Kommunikation identifiziert, und die Untersuchungen mit der analog-sensitiven Kinase COT-1M291A verdeutlichen, dass die Kinaseaktivität von COT-1 nicht nur für das polare Wachstum, sondern auch – direkt oder indirekt – für das präzise Zusammenspiel der Proteine der Zell-Zell-Interaktion entscheidend ist.

The focus of this study was the investigation of the serine/threonine kinase COT-1 in the filamentous ascomycete Neurospora crassa. Previous work had been based on the temperature-sensitive mutant cot-1. To enable targeted functional characterization, an analog-sensitive variant (COT-1M291A) was established, allowing chemical control of kinase activity. This made it possible, for the first time, to perform microscopic analyses of cells with temporally inhibited COT-1 activity and to gain novel time-resolved insights into its function. Inhibition of COT-1 resulted in strongly hyperbranched growth of hyphae and germinating conidiospores, as well as markedly reduced cell–cell interactions during somatic cell fusion. In contrast to classical fusion mutants, this process was never completely abolished. Studies of fluorescently tagged proteins mediating cell communication revealed frequent mislocalization at hyphal tips. Moreover, these tips showed pronounced accumulation of polarity markers such as the formin BNI-1 and actin. The observation of GUL-1-dependent stress granules in cells with reduced COT-1 activity suggests that COT-1 participates in their dissolution via phosphorylation of the mRNA-binding protein GUL-1. Insufficient phosphorylation may cause persistent stress granule formation, leading to the characteristic growth defect of the mutant. Furthermore, attempts were made to localize the cell wall sensors WSC-1 and HAM-7 by fluorescence microscopy, as cells with diminished COT-1 activity exhibit thickened cell walls. Although direct visualization was unsuccessful, the experiments yielded functional insights: WSC-1 does not appear to be solely responsible for activation of the MAP kinase MAK-1, since MAK-1-GFP remained localized at cell contact sites even in the Δwsc-1 strain. The results indicate alternative signalling pathways for the activation of MAK-1. In another part of this work, the previously uncharacterized gene NCU00938 (ham-15) was examined, revealing its central role in colony establishment. Deletion of this gene caused a complete loss of cell–cell communication and a markedly delayed colony development. Interestingly, Δham-15 germlings were occasionally able to interact and fuse with wild-type cells.

The findings of this study integrate into the complex cellular processes underlying cell–cell interaction and expand the current working model of somatic cell fusion in N. crassa. With HAM-15, a new factor involved in fungal cell communication was identified, and analyses using the analog-sensitive kinase COT-1M291A demonstrated that COT-1 kinase activity is essential not only for proper polarized growth but also—directly or indirectly—for the precise coordination of proteins required for cell–cell interaction.