Annexins to the Rescue : First Responders to Fight Loss of Membrane Integrity in Neurospora crassa
The plasma membrane forms a crucial barrier between the cytosol and the outer environment. Rupture of the plasma membrane allows mixture of intra- and extracellular components, leading to chemical imbalance within the cell and subsequent cell death. Restoration of membrane integrity is therefore essential for cell survival. Threats to membrane integrity include mechanically induced wounding — such as that occurring during cell-cell fusion — and exposure to membrane-targeting substances, including plant defense compounds. To counteract these events, cells have evolved a variety of mechanisms to mend membrane disruptions, collectively termed as membrane repair mechanisms. These processes involve Ca2+-signaling, cytoskeleton remodeling, and targeted recruitment of cellular components to the site of injury. To investigate the molecular basis of fungal membrane repair, the filamentous ascomycete Neurospora crassa was employed. This work identified the proteins PEF1, ANX14, and ANXC4 as key players in membrane repair, each with distinct but partially overlapping functions. To assess their function, gene knockout mutants were analyzed during mechanically induced damage. Deletion of anx14 or anxc4 led to increased lysis rates in fusing germling pairs compared to the wild type and the Δpef1 mutant. Notably, lysis rates doubled in the Δpef1 Δanx14 double mutant, suggesting that PEF1 and ANX14 operate through independent repair pathways. To examine repair in response to chemically induced damage, spore dilution spot assays were performed on media containing various antifungal compounds. These assays revealed that deletion of pef1, but not anx14 or anxc4, impaired colony growth under stress conditions. These findings indicate that annexins may be more critical for repairing mechanically induced membrane disruptions, while PEF1 plays a more prominent role in responding to membrane-targeting substances. Life-cell imaging and subcellular localization studies of GFP-fusion strains further support these distinctions: both ANX14 and PEF1 localize to the membrane following mechanical and chemical injury. However, ANX14 recruitment spans the entirety of the plasma membrane, while PEF1 accumulates in discrete spots at the membrane, likely corresponding to the site of injury. Interestingly, ANXC4 is not recruited under normal conditions, but in the absence of ANX14, it is partially recruited, suggesting a potential compensatory mechanism among annexins. Additional evidence implicates that the cytoskeletal protein actin plays a role in membrane repair. Actin accumulates at the membrane after exposure to antifungal substances. Inhibition of actin polymerization using latrunculin A abolishes PEF1 recruitment, while ANX14 recruitment remains unaffected. This strikingly different behavior of PEF1 and ANX14 reinforces the hypothesis that both proteins function in distinct membrane repair mechanisms. Altogether, these findings contribute to a more comprehensive model of membrane repair in N. crassa, highlighting the interplay between proteins and cytoskeletal components. Within this framework, this thesis underscores the biological significance of rapid, context specific membrane repair responses in filamentous fungi.
Die Plasmamembran bildet eine wichtige Barriere zwischen dem Zytosol und der äußeren Umgebung von Zellen. Ein Riss in der Plasmamembran ermöglicht die Vermischung intra- und extrazellulärer Komponenten, was zu einem chemischen Ungleichgewicht innerhalb der Zelle und in der Folge zum Zelltod führt. Die Wiederherstellung der Membranintegrität ist daher essenziell für das Überleben der Zelle. Zu den Gefahren für die Membranintegrität zählen mechanisch verursachte Verletzungen – wie sie beispielsweise bei der Zell-Zell-Fusion auftreten – sowie die Exposition gegenüber membranschädigenden Substanzen, einschließlich pflanzlicher Abwehrstoffe. Um solchen Ereignissen entgegenzuwirken, haben Zellen eine Vielzahl von Mechanismen zur Reparatur von Membranschäden entwickelt, die zusammenfassend als Membranreparaturmechanismen bezeichnet werden. Diese Prozesse umfassen Ca2+-Signalgebung, Umstrukturierung des Zytoskeletts sowie die gezielte Rekrutierung zellulärer Komponenten an den Ort der Verletzung. Um die molekularen Grundlagen der Membranreparatur bei Pilzen zu untersuchen, wurde der filamentöse Ascomycet Neurospora crassa verwendet. In dieser Arbeit wurden die Proteine PEF1, ANX14 und ANXC4 als Schlüsselakteure bei der Membranreparatur identifiziert, wobei diese jeweils unterschiedliche, jedoch teilweise überlappende Funktionen haben. Zur funktionellen Charakterisierung wurden Gen-Knockout-Mutanten während mechanisch induzierter Schädigungen analysiert. Die Deletion von anx14 oder anxc4 führte im Vergleich zum Wildtyp und zur Δpef1-Mutante zu erhöhten Lyseraten in fusionierenden Keimlingspaaren. Besonders auffällig war, dass sich die Lyseraten in Δpef1 Δanx14-Doppelmutanten verdoppelten, was darauf hindeutet, dass PEF1 und ANX14 in unabhängigen Reparaturwegen wirken. Zur Untersuchung der Reparaturreaktion auf chemisch induzierte Membranschäden wurden Sporenverdünnungs-Spot-Assays auf Medien mit verschiedenen antimykotischen Substanzen durchgeführt. Diese Experimente zeigten, dass die Deletion von pef1, nicht jedoch von anx14 oder anxc4, das Koloniewachstum unter Stressbedingungen beeinträchtigte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Annexine vor allem für die Reparatur mechanisch verursachter Membrandefekte von Bedeutung sind, während PEF1 eine zentralere Rolle bei der Reaktion auf membranschädigende Substanzen spielt. Life-cell-imaging sowie die Analyse der subzellulären Lokalisation von GFP-Fusionsproteinen untermauern diese funktionellen Unterschiede: Sowohl ANX14 als auch PEF1 werden nach mechanischer und chemischer Schädigung an die Membran rekrutiert. Während sich ANX14 über die gesamte Plasmamembran verteilt, akkumuliert PEF1 in diskreten Punkten an der Membran, die vermutlich den Ort der Verletzung entsprechen. Interessanterweise wird ANXC4 unter normalen Bedingungen nicht rekrutiert, zeigt jedoch in Abwesenheit von ANX14 eine partielle Rekrutierung, was auf einen möglichen kompensatorischen Mechanismus innerhalb der Annexin-Familie hindeutet. Weitere Hinweise legen nahe, dass das Zytoskelettprotein Aktin eine Rolle bei der Membranreparatur spielt. Nach Exposition gegenüber antimykotischen Substanzen akkumuliert Aktin an der Membran. Die Hemmung der Aktinpolymerisation mit Latrunculin A verhindert die Rekrutierung von PEF1 vollständig, während die Rekrutierung von ANX14 nicht beeinflusst wird. Dieses deutlich unterschiedliche Verhalten von PEF1 und ANX14 stützt die Hypothese, dass beide Proteine in voneinander unabhängigen Membranreparaturmechanismen wirken. Insgesamt tragen diese Erkenntnisse zu einem umfassenderen Modell der Membranreparatur in N. crassa bei und verdeutlichen die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Komponenten des Zytoskeletts. In diesem Rahmen unterstreicht diese Arbeit die biologische Bedeutung schneller, kontextspezifischer Membranreparaturreaktionen in filamentösen Pilzen.
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