Capillary-Based Analytical Methods for Collagen Binding Studies
In the context of this doctoral thesis, methods for affinity investigations of a reprocessed collagen sample and proteins were developed using capillary electrophoresis, microscale thermophoresis and spectral shift analysis. The collagen source material was provided by botiss biomaterials GmbH and represents a prototype for use in dental wound healing. Due to collagen being insoluble under physiological conditions, the raw fleece material was ground, resuspended and finally freeze-dried, to achieve defined mass concentrations in later experiments. Subsequently, the resulting suspension was analyzed by raster electron microscopy and particle size distribution. The particles were of various shapes and sizes (approximately 3 - 1000 μm in diameter), which tend to aggregate depending on their concentration and pre-treatment. Furthermore, the collagen was examined using CE-SDS. However, the method was not optimal because electrokinetic injection and denaturation of large collagen particles proved problematic. In contrast, the separation of commercial rat tail collagen dissolved in acetic acid was more successful and in accordance with literature values. The majority of this study focuses on method development using mobility shift affinity capillary electrophoresis (msACE). The principle of this technique is based on changes in electrophoretic mobility depending on ligand concentration. Hence, binding constants serve as parameters to characterize the strength of interactions, which are determined by non-linear least squares fitting of experimental data to a model function. In this work, an msACE method was successfully developed, which investigated the affinity of reprocessed collagen to epidermal growth factor (EGF) as model protein. The specialties were the use of an LEDIF detector, the application of constant power instead of constant voltage and the use of suspensions instead of solutions. In addition, the influence of viscosity and dielectricity has been studied and included in the form of correction factors. The influence of the EOF when using a coated capillary and the effect of buffer depletion were further considered. As a result, an affinity between collagen and EGF was found, although molar binding constants could not be determined due to the lack of molecular weight of collagen. In addition, two modern capillary based methods for measuring interactions were presented by microscale thermophoresis (MST) and spectral shift (SpS) analytic, which are combined into one device. MST is based on a change in fluorescence signal upon heating, while SpS is founded on a shift in emission spectra, both of which depend on the binding behavior of a ligand. Consequently, a binding to the reprocessed collagen was indicated for EGF, vascular endothelial growth factor (VEGF) and human serum albumine (HSA).
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden Methoden zu Affinitätsuntersuchungen einer aufgearbeiteten Kollagenprobe und Proteinen mittels Kapillarelektrophorese, Microscale Thermophorese und Spectral Shift Analysetechnik entwickelt. Das Kollagenprodukt ist ein Prototyp der Firma botiss biomaterials GmbH und soll zur Wundheilung im Dentalbereich eingesetzt werden. Da Kollagen unter physiologischen Bedingungen nicht löslich ist, wurde das Vlies gemahlen, resuspendiert und anschließend gefriergetrocknet, sodass für anschließende Versuche definierte Massenkonzentrationen genutzt werden konnten. Die so erhaltene Suspension wurde mittels Rasterelektronenmikroskop und hinsichtlich ihrer Partikelgrößenverteilung untersucht. Die Partikel sind von unterschiedlicher Form und Größe (ca. 3 - 1000 μm Durchmesser), die je nach Konzentration und Vorbehandlung zur Aggregation neigen. Darüber hinaus wurde versucht, die Kollagenprobe mittels CE-SDS zu charakterisieren. Die Methode war dabei nicht optimal geeignet, da sich die elektrokinetische Injektion und die Denaturierung der Kollagenpartikel als problematisch erwiesen. Die Trennung eines kommerziellen Rattenschwanzkollagens, welches in Essigsäure gelöst wurde, war hingegen größtenteils erfolgreich und stimmt mit Literaturwerten überein. Der größte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Methodenentwicklung im Bereich der mobility shift Affinitätskapillarelektrophorese (msACE). Das Prinzip dabei basiert auf einer Änderung der elektrophoretischen Mobilität in Abhängigkeit der Ligandenkonzentration. Die Stärke der Interaktion kann anhand von Bindungskonstanten beurteilt werden, die mittels nicht-linearer Regression aus experimentellen Daten anhand einer Modellfunktion berechnet werden. In dieser Arbeit wurde erfolgreich eine msACE Methode zur Untersuchung der Affinität des aufbereiteten Kollagenproduktes mit Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) als Modellprotein entwickelt. Besonderheiten sind dabei die Verwendung eines LEDIF Detektors, das Anlegen von konstanter Leistung statt konstanter Spannung und die Messung mit Suspensionspartikeln. Darüber hinaus wurden die Einflüsse von Viskosität und Dielektrizität ermittelt und als Korrekturfaktoren mit einbezogen. Außerdem wurde der Einfluss des EOFs bei Benutzung einer beschichteten Kapillare, sowie der Effekt der Abnahme der Pufferkapazität untersucht. Es konnte eine Affinität zwischen Kollagen und EGF festgestellt werden, auch wenn aufgrund des fehlenden Molekulargewichts von Kollagen keine molaren Bindungskonstanten ermittelt werden konnten. Zwei moderne kapillarbasierte Methoden zu Interaktionsuntersuchungen stellen die Microscale Thermophorese (MST) und Spectral Shift (SpS) Analytik dar, welche in einem Gerät vereint sind. MST basiert auf einer Änderung des Fluoreszenzsignals bei Erhitzen, SpS hingegen auf der Verschiebung des Emissionsspektrums in Abhängigkeit des Bindeverhaltens. Eine Bindung zum Kollagenprodukt konnte hier für den vaskulär endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Albumin (HSA) und EGF festgestellt werden.
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