HPLC-basierte analytische Untersuchung von möglichen pharmakologisch relevanten Reaktionen antitumoraler Ruthenium(II)-Komplexe mit N-heterozyklischem Carben und variierter Abgangsgruppe

Schneeberg, Pia

doi:10.24355/dbbs.084-202509011946-0

Thesis Thu Sep 4 2025 CC BY-NC-ND 4.0

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HPLC-basierte analytische Untersuchung von möglichen pharmakologisch relevanten Reaktionen antitumoraler Ruthenium(II)-Komplexe mit N-heterozyklischem Carben und variierter Abgangsgruppe

Schneeberg, Pia Tessa

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In dieser Arbeit wurde für die bereits etablierte Verbindung (1,3-Dibenzyl-5-methylbenzimidazol-2‑yliden)-dichlorido-(η⁶-p-cymol)-ruthenium(II) eine HPLC-Methode mit UV- und MS-Detektion entwickelt und validiert, um mit dieser die Stabilität und mögliche Bindungsreaktionen des Rutheniumkomplexes in biologisch relevanten Medien zu untersuchen. Die Zielsetzung dieser Untersuchungen war die Bestimmung von Abbaureaktionen und Metaboliten sowie das Generieren von Hinweisen auf eine mögliche Wirkform und potentielle Targets.

Mithilfe der neu entwickelten HPLC-Methode wurde zunächst die Stabilität der Verbindung in verschiedenen Lösungsmitteln sowie in wässrigen Medien untersucht. Bei der Stabilität in wässrigen Systemen wurden verschiedene Puffer in einem pH-Bereich von 4,0 bis 8,0 sowie verschiedene physiologisch relevante Natriumchloridkonzentrationen eingesetzt. Zudem wurde die Verbindung bei variierter Temperatur und in Zellkulturmedium untersucht, das in in vitro-Untersuchungen verwendet wird. Dabei wurde der Einfluss der Bedingungen auf die Stabilität des Rutheniumkomplexes evaluiert, Abbaureaktionen und –produkte identifiziert und die Freisetzung der verschiedenen Liganden untersucht. Die Ergebnisse konnten anhand ausgewählter Bedingungen durch zusätzliche UV-Vis-spektroskopische Untersuchungen bestätigt werden. Neben diesen Stabilitätsuntersuchungen wurde der Rutheniumkomplex in biologischen Matrices mit ausgewählten Biomolekülen inkubiert. Anhand dieser Untersuchungen konnten die Bindungsaffinitäten zu verschiedenen funktionellen Gruppen und Biomolekülen verglichen sowie Bindungskinetiken und –abläufe betrachtet werden. Basierend auf den Ergebnissen der Stabilitäts- und Bindungsuntersuchungen wurde die Abgangsgruppe der Verbindung synthetisch durch die Einführung eines zweizähnigen Liganden modifiziert. Es konnten Syntheseverfahren für die Isolierung der Verbindungen (1,3-Dibenzyl-5-methylbenzimidazol-2-yliden)-oxalato-(η⁶-p-cymol)-ruthenium(II), (1,3-Dibenzyl-5-methylbenzimidazol-2-yliden)-salicylato-(η⁶-p‑cymol)-ruthenium(II) und (1,3-Dibenzyl-5-methylbenzimidazol-2-yliden)-carbonato-(η⁶-p-cymol)-ruthenium(II) entwickelt werden. Auch für diese Rutheniumkomplexe wurde die Stabilität mittels UV-Vis-Spektroskopie untersucht und die Auswirkungen der Abgangsgruppe in Bezug auf die Eigenschaften in wässrigen Medien verglichen. Für tiefergehende Untersuchungen der Stabilität und Bindungsreaktionen mittels HPLC wurde die stabilste Verbindung mit Oxalatsubstituenten ausgewählt. Nach Validierung der HPLC-Methode für den Komplex wurde die Stabilität in Lösungsmitteln, in Wasser und in physiologisch relevanten Puffern sowie in Zellkulturmedium untersucht. In den nachfolgenden Bindungsuntersuchungen mit verschiedenen Biomolekülen wurde der Einfluss der höheren Stabilität des Komplexes durch die synthetische Einführung des Oxalatliganden auf Bindungspräferenzen und –kinetiken im Vergleich zur Ausgangsverbindung untersucht.

Um die Bedingungen in in vitro-Zellversuchen zu simulieren und die Reaktionen darin zu untersuchen, wurden alle synthetisierten Verbindungen mittels HPLC in verschiedenen Zellkulturmedien vergleichend untersucht und der Fokus dabei auf darin ablaufende Bindungsreaktionen gelegt. Neben der HPLC-basierten vergleichenden Untersuchung der Rutheniumkomplexe wurde ihre antiproliferative Aktivität in einem Zellviabilitätstest verglichen und die Aufnahme in Tumorzellen mittels Atomabsorptionsspektroskopie untersucht. Abschließend konnten aus der Gesamtheit der Ergebnisse Hypothesen für die Reaktionen, die in in vitro-Untersuchungen und nach Applikation ablaufen könnten, geschlussfolgert werden.

In this work, an HPLC method with UV and MS detection was developed and validated for the established compound (1,3-dibenzyl-5-methylbenzimidazole-2-ylidene)-dichlorido-(η⁶-p-cymene)-ruthenium(II) in order to investigate the stability and binding reactions of the ruthenium complex in biologically relevant media. The objective of these studies was to identify degradation reactions and metabolites. Furthermore, the investigations aimed to gain evidence of a possible active form and potential targets.

Using the newly developed HPLC method, the stability of the compound in different solvents and in aqueous media was initially investigated. Buffers in the pH range of 4.0 to 8.0 and various physiologically relevant concentrations of sodium chloride were used to study the stability in aqueous systems. In addition, the compound was examined at varying temperatures and in cell culture medium, which is used in in vitro studies. The influence of the conditions on the stability of the ruthenium complex was evaluated, degradation reactions and products were identified and the release of the ligands was investigated. The results were confirmed by additional UV-Vis spectroscopic studies under selected conditions. Along with the stability studies, the ruthenium complex was incubated in biological matrices with selected biomolecules. These investigations allowed to compare the binding affinities to different functional groups and biomolecules. Furthermore, different binding kinetics and processes were observed. Based on the results of the stability and binding studies, the leaving group of the compound was synthetically modified by introducing a bidentate ligand. Synthesis procedures were developed for the isolation of the compounds (1,3-dibenzyl-5-methylbenzimidazol-2-ylidene)-oxalato-(η⁶-p-cymene)-ruthenium(II), (1,3-dibenzyl-5-methylbenzimidazol-2-ylidene)-salicylato-(η⁶-p-cymene)-ruthenium(II) and (1,3-dibenzyl-5-methylbenzimidazol-2-ylidene)-carbonato-(η⁶-p-cymene)-ruthenium(II). Analogously to the parent compound, the stability of these ruthenium complexes was investigated using UV-Vis spectroscopy. The effects of the leaving group on the reactions in aqueous media were then compared. The most stable compound with the bidentate oxalato ligand was selected for in-depth investigations of stability and binding reactions using HPLC. Subsequent to the validation of the HPLC method for the complex, the stability in solvents, in water and in physiologically relevant buffers as well as in cell culture medium was investigated. Consequently, binding studies with different biomolecules were then conducted to investigate the influence of the enhanced stability of the complex due to the synthetic introduction of the oxalato ligand on binding preferences and kinetics compared to the parent compound.

In order to simulate the conditions of in vitro cell experiments and to examine the reactions therein, all synthesized compounds were studied by HPLC in different cell culture media. Their reactions were comparatively analyzed, with a particular emphasis on the binding of the compounds to biomolecules. In addition to the HPLC-based comparative investigation of the ruthenium complexes, their antiproliferative activity was compared in a cell viability test and their uptake in tumor cells was studied using atomic absorption spectroscopy. Finally, in consideration of all collected results hypotheses regarding potential reactions of the ruthenium complexes in in vitro studies and after application were formulated.