Challenges and possibilities for novel antibiotic targeting Pseudomonas aeruginosa IspE

Ornago, Camilla

doi:10.24355/dbbs.084-202505081106-0

Thesis Thu May 8 2025 CC BY-NC-SA 4.0

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Challenges and possibilities for novel antibiotic targeting Pseudomonas aeruginosa IspE

Ornago, Camilla

English
German

Research into new antibiotics is vital to address the escalating problem of antimicrobial resistance (AMR). IspE, a kinase in the MEP pathway, is a promising target for developing antibiotics. This study focused on identifying inhibitors for IspE from Pseudomonas aeruginosa (PaIspE) using innovative Structure-Based and Fragment-Based Drug Design (SBDD and FBDD). PaIspE was characterized, and its crystal structure with CDP-ME was resolved at 2.3 Å. Experimental SEC-MALS measurements and analysis of other Protein Data Bank (PDB) entries confirmed PaIspE as a monomer in solution, invalidating strategies to target its oligomerisation. Despite prior work showing IspE bound ATP in an unusual syn-conformation, this pocket was rarely targeted in drug discovery. Collaborative analysis with BioSolveIT showed that syn-ATP was present in only 4% of over 8000 PDB entries and was more common in prokaryotes than eukaryotes, suggesting the ATP-binding pocket is a promising target.

Additionally, the thesis reported three complementary and parallel approaches for the discovery of new fragments and molecules targeting PaIspE. In the first project in collaboration with the company SPECS e-Molecules, 152 commercially available fragments were screened for PaIspE binding utilising thermal shift assay (TSA), a classical biophysical method. Three molecules showed 33-100% inhibition of PaIspE. They shared the same scaffold, corroborating the hypothesis that it could be a new promising IspE inhibitor. The optimization of an apo-crystal of Aquifex aeolicus IspE was pivotal for a crystallographic fragment screen (CFS) performed in collaboration with Helmoltz-Zentrum Berlin and MAV IV Laboratories. The project yielded four fragment hits, one of which bound in the active site. Although it was expected to be the primary target of the screen, the ATP binding pocket was not targeted by any fragment. The result was possibly due to the repulsive forces of the negatively charged AaIspE surface and the poor accessibility of the active site in the unit cell. Three fragments were identified binding to obscure pockets of AaIspE. The relevance of the results and the possibility to exploit the unexpected binding modes of these three fragments would require future careful analysis. The last approach was conducted in collaboration with BioSolveIT and aimed to target the adenine syn-conformation of ATP. The chemical space docking (CSD) was performed using the AaIspE-ATP structure as a template. Five of the forty-two molecules purchased from the company Enamine were validated as PaIspE inhibitors. The CSD yielded a higher percentage of active molecules than the previous two protects, demonstrating that the combination of SBDD and FBDD with a novel computational method that allows exploration of a chemical space to develop synthesis-on-demand compounds was a successful strategy for the first step of drug discovery, even for non-trivial targets such as IspE. Structural and biophysical studies of the hits obtained in these studies are currently being carried out.

In conclusion, this study resulted in the structural characterization a new ortholog of IspE from the highly relevant pathogen P. aeruginosa. Consequently, ten molecules targeting PaIspE were identified through a combination of methods and techniques that provide new routes for hit-to-lead optimisation.

Die Forschung an neuen Antibiotika ist entscheidend, um das wachsende Problem der antimikrobiellen Resistenz (AMR) anzugehen. IspE, eine Kinase im MEP-Weg, ist ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung neuer Antibiotika. Diese Studie konzentrierte sich darauf, Inhibitoren für IspE aus Pseudomonas aeruginosa (PaIspE) mithilfe innovativer Struktur- und Fragment-basierter Wirkstoffdesign-Ansätze (SBDD und FBDD) zu identifizieren. PaIspE wurde charakterisiert, und seine Kristallstruktur mit CDP-ME wurde bei einer Auflösung von 2,3 Å bestimmt. Experimentelle SEC-MALS-Messungen und die Analyse anderer Einträge in der Protein Data Bank (PDB) bestätigten, dass PaIspE in Lösung als Monomer vorliegt, wodurch Strategien zur Hemmung durch Oligomerisierung des Proteins ausgeschlossen wurden. Trotz früherer Arbeiten, die zeigten, dass IspE ATP in einer ungewöhnlichen Syn-Konformation bindet, wurde diese Bindungstasche selten in Wirkstoffforschungsprojekten ins Visier genommen. Eine kollaborative Analyse mit BioSolveIT zeigte, dass Syn-ATP in nur 4% von über 8000 PDB-Einträgen vorkam und in Prokaryoten häufiger anzutreffen war als in Eukaryoten. Dies deutet darauf hin, dass die ATP-Bindungstasche ein vielversprechendes Ziel darstellt.

Darüber hinaus wurden in der Dissertation drei komplementäre und parallele Ansätze zur Entdeckung neuer Fragmente und Moleküle, die auf PaIspE abzielen, vorgestellt. Im ersten Projekt, in Zusammenarbeit mit dem Unternehmen SPECS e-Molecules, wurden 152 kommerziell erhältliche Fragmente mithilfe des Thermal Shift Assay (TSA), einer klassischen biophysikalischen Methode, auf ihre Bindung an PaIspE untersucht. Drei Moleküle zeigten eine 33-100%ige Hemmung von PaIspE. Sie wiesen dasselbe molekulare Grundgerüst auf, was die Hypothese bestätigte, dass es sich dabei um einen neuen vielversprechenden IspE-Inhibitor handeln könnte. Die Optimierung eines Apo-Kristalls von Aquifex aeolicus IspE war entscheidend für ein kristallographisches Fragment-Screening (CFS), das in Zusammenarbeit mit dem Helmholtz-Zentrum Berlin und den MAV IV Laboratories durchgef¨uhrt wurde. Das Projekt ergab vier Fragmenttreffer, von denen einer im aktiven Zentrum gebunden wurde. Obwohl erwartet wurde, dass es das primäre Ziel des Screenings sein würde, wurde die ATP Bindungstasche von keinem Fragment ins Visiergenommen. Das Ergebnis war möglicherweise auf die abstosenden Kräfte der negativ gela-denen Oberfläche von AaIspE und die schlechte Zugänglichkeit des aktiven Zentrums in der Einheitszelle zurückzuführen. Es wurden drei Fragmente identifiziert, die an verborgene Taschen von AaIspE binden. Die Relevanz der Ergebnisse und die Möglichkeit, die unerwarteten Bindungsmodi dieser drei Fragmente zu nutzen, müssten in Zukunft sorgf ¨ altig analysiert werden. Der letzte Ansatz wurde in Zusammenarbeit mit BioSolveIT durchgeführt und zielte auf die Adenin-syn-Konformation von ATP ab. Die Chemical Space Docking (CSD) wurde unter Verwendung der AaIspE-ATP-Struktur als Vorlage durchgeführt. Fünf der zweiundvierzig von der Firma Enamine gekauften Molek¨ ule wurden als PaIspE-Inhibitoren validiert. Das CSD ergab einen höheren Prozentsatz aktiver Moleküle als die beiden vorherigen Verfahren, was zeigt, dass die Kombination von SBDD und FBDD mit einer neuartigen Berechnungsmethode, die die Erkunvdung eines chemischen Raums zur Entwicklung von Synthese-on-Demand-Verbindungen ermöglicht, eine erfolgreiche Strategie für den ersten Schritt der Arzneimittelentdeckung war, selbst für nicht triviale Ziele wie IspE. Die in diesen Studien erzielten Treffer werden derzeit strukturell und biophysikalisch untersucht.

Zusammenfassend führte diese Studie zur strukturellen Charakterisierung eines neuen Orthologs von IspE aus dem hochrelevanten Pathogen P. aeruginosa. Infolgedessen wurden zehn Moleküle, die auf PaIspE abzielen, durch eine Kombination von Methoden und Techniken identifiziert, die neue Wege für die Hit-to-Lead-Optimierung bieten.