Final Report : Development of microreactors for biopharmaceutical applications / Open capillary wave micro-reactor for biopharmaceutical screening applications
The objective of the project was to develop a parallelized droplet-based microbioreactor (MBR) with a high sensor implementation for cell-based assays and biopharmaceutical applications. A capillary wave microbioreactor (cwMBR, reaction volume 7 μL) in monolithic design was developed, fabricated and comprehensively characterized using femtosecond laser direct writing and chemical etching techniques in fused silica. A suitable mixing technique based on vertical oscillation was designed for the small volume of liquid. The induced vertical oscillation leads to an oscillation of the liquid surface corresponding to the frequency and deflection. On this basis, the resonant frequency of the liquid was identified as the decisive factor for the mixing performance. By applying this vertical oscillation method, excellent mixing times < 2 s and exceptionally high volumetric mass transfer coefficients of 340 h-1 were achieved. Furthermore, the influence of different oscillation settings and the resulting effects on the cell growth of Escherichia coli with different vibration settings were investigated. In further work, the cwMBR array was extended to a platform consisting of nine cwMBRs with an automated liquid dosing system and equipped with extensive online sensor technology (including liquid control, resonance monitoring, pH value, dissolved oxygen and glucose concentration, optical density and impedance). As application examples, phagogram lysis kinetics and live/dead analyses of mammalian cell cultures were performed in the cwMBR platform. Phagograms are sensitivity tests of bacteria to bacteriophages, which are essential for the implementation of phage therapies to combat multi-resistant bacteria. In order to increase throughput, reduce laboratory workload and increase reproducibility, the automation of the developed cwMBR platform for phagograms in phage therapy was advanced. The applicability of the platform was demonstrated using the example of recording lysis kinetics in phagograms with E. coli and automated phage addition. The results show a clear lysis of the bacteria by the phages and thus confirm the applicability of automated phagogram generation in the highly parallelizable cwMBR platform. An automated, parallelized screening tool based on a fully sensor-equipped cwMBR platform is now available. Only minor changes to the platform are required to perform fully automated high-throughput phagograms in the future. These include:
- the expansion of the nanodispenser unit for additional phage suspensions and a device for flexible switching between different phage solutions, water for liquid level control, detergents or disinfectants to avoid cross-contamination, and
- the significant increase in parallelization in a second dimension in order to further increase the number of parallel experiments for additional bioprocess engineering applications.
Die Zielsetzung des Projektes bestand darin, einen parallelisierten Tropfenbasierten Mikrobioreaktor (MBR) mit einer hohen Sensorimplementierung für Zell-basierte Assays und biopharmazeutische Anwendungen zu entwickeln. Es wurde ein Kapillarwellen-Mikrobioreaktor (cwMBR, Reaktionsvolumen 7 μL) in monolithischer Bauweise mittels Femtosekunden-Laser-Direct-Writing-Verfahren und chemischer Ätztechnik in Quarzglas entwickelt, gefertigt und umfassend charakterisiert. Für das geringe Flüssigkeitsvolumen wurde eine geeignete Mischtechnik auf Grundlage vertikaler Schwingungen konzipiert. Die induzierte vertikale Schwingung führt zu einer der Frequenz und der Auslenkung entsprechenden Schwingung der Flüssigkeitsoberfläche. Auf dieser Grundlage wurde die Resonanzfrequenz der Flüssigkeit als der entscheidende Faktor für die Mischleistung identifiziert. Durch die Anwendung dieser vertikalen Oszillationsmethode konnten hervorragende Mischzeiten < 2 s und außergewöhnlich hohe volumetrische Stoffübergangskoeffizienten von 340 h-1 erzielt werden. Weiterhin wurde der Einfluss unterschiedlicher Oszillationseinstellungen und die daraus resultierenden Auswirkungen auf das Zellwachstum von Escherichia coli mit unterschiedlichen Vibrationseinstellungen untersucht. Der cwMBR-Array wurde in weiterführenden Arbeiten auf eine aus neun cwMBRs bestehende Plattform mit automatisiertem Flüssigkeitsdosiersystem erweitert und mit einer umfangreichen online-Sensorik (u. a. Flüssigkeitskontrolle, Resonanzüberwachung, pH-Wert, gelöste Sauerstoff- und Glukosekonzentration, optische Dichte und Impedanz) ausgestattet. Als Anwendungsbeispiele wurden Phagogramm-Lysekinetiken und Lebend/Tot-Analysen von Säugetierzellkulturen in der cwMBR-Plattform durchgeführt. Bei Phagogrammen handelt es sich um Sensitivitätstests von Bakterien gegenüber Bakteriophagen, die für die Durchführung von Phagentherapien zur Bekämpfung multiresistenter Bakterien unerlässlich sind. Um den Durchsatz zu erhöhen, den Laboraufwand zu reduzieren und
die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, wurde die Automatisierung der entwickelten cwMBRPlattform für Phagogramme in der Phagentherapie vorangetrieben. Die Anwendbarkeit der Plattform wurde am Beispiel zur Aufnahme von Lysekinetiken in Phagogrammen mit E. coli und automatisierter Phagenzugabe aufgezeigt. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Lyse der Bakterien durch die Phagen und bestätigen damit die Anwendbarkeit der automatisierten Phagogramm-Erstellung in der hochparallelisierbaren cwMBR-Plattform. Es steht nunmehr ein automatisiertes, parallelisiertes Screening-Tool auf Basis einer vollständig mit Sensoren ausgestatteten cwMBR-Plattform zur Verfügung. Es sind nur geringfügige Änderungen an der Plattform erforderlich, um in Zukunft vollautomatisierte Hochdurchsatz-Phagogramme durchzuführen. Dazu gehören:
- die Erweiterung der Nanodispenser-Einheit für weitere Phagensuspensionen und eine Vorrichtung zum flexiblen Wechsel zwischen verschiedenen Phagenlösungen, Wasser zur Füllstandsregulierung, Detergenzien oder Desinfektionsmitteln zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen sowie
- die deutliche Erhöhung der Parallelisierung in einer zweiten Dimension, um die Anzahl der parallelen Experimente für weitere bioprozesstechnische Anwendungen weiter zu erhöhen.
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