PhzF als potentielle Zielstruktur für Pseudomonas-Pathoblocker

Pseudomonas aeruginosa ist ein gram-negativer Krankheitserreger, der vor allem für immungeschwächte Patienten und im Krankenhausumfeld problematisch ist. Antimikrobielle Resistenzen gegen die bei einer Infektion eingesetzten Antibiotika erfordern neue Therapieansätze. Einer dieser Ansätze ist das Pathoblocker-Konzept. Dabei wird die Virulenz eines Krankheitserregers verringert, ohne das Bakterium abzutöten. Aufgrund ihres geringeren Selektionsdrucks kann eine verringerte Resistenzentwicklung gegen diese Pathoblocker erwartet werden.

Eine mögliche Zielstruktur für Pathoblocker ist das Enzym PhzF, ein essentieller Katalysator der Phenazinbiosynthese von Pseudomonaden. Das Phenazin Pyocyanin agiert hierbei als Virulenzfaktor und ist aufgrund seiner Redoxaktivität für die Pathogenität von P. aeruginosa erforderlich. Vorherige Untersuchungen haben die Struktur von PhzF mit röntgenkristallographischen Methoden aufgeklärt und gezeigt, dass die Isomerase zwei verschiedene Konfigurationen annehmen kann: Eine offene apo-Konformation und eine geschlossene Konformation, bei der entweder das Substrat 2,3-Dihydro-3-hydroxyanthranilsäure (DHHA) oder das Substratanalogon 3-Hydroxyanthranilsäure (3-HAA) gebunden ist.

Auf der Grundlage der Co-Kristallstruktur wurden zunächst 3-HAA-Analoga für die geschlossene Konformation entworfen und anschließend erworben oder synthetisiert. Die Bindung der Liganden an PhzF wurde mit einem nDSF- und einem FRET-Assay untersucht. Keine der untersuchten Verbindungen zeigte eine höhere Affinität zu PhzF als 3-HAA. Eine Co-Kristallstruktur von 3-Ethoxyanthranilsäure mit PhzF zeigte die räumlichen Einschränkungen der geschlossenen Konformation. Eine sinnvolle Weiterentwicklung dieser 3-HAA-Analoga erschien aufgrund dieses beschränkten Platzes zweifelhaft. Deswegen wurden mit einem virtuellen fragment-basierten Designansatz Liganden für die offene PhzF-Konformation entworfen. Von den entwickelten und synthetisierten 5-phenylsubstituierten Anthranilsäuren wurden erstmals Co-Kristallstrukturen mit der offenen Konformation des nativen PhzF aufgeklärt. Die Liganden zeigten einen aus dem Design nicht erwarteten Bindungsmodus. Die Affinität der 5-phenylsubstituierten Anthranilsäuren zu PhzF war wesentlich geringer als die von 3-HAA, die offene Konformation von PhzF bietet aber ausreichend Platz für die weitere Optimierung der Liganden. Keiner der entwickelten Liganden war in der Lage die Pyocyaninproduktion von P. aeruginosa zu verringern. Die negativ geladene Carbonsäurefunktion verhindert vermutlich die Aufnahme in die Bakterienzelle. Ein bioisosterer Austausch gegen eine Nitro- oder Amidgruppe oder die Maskierung der Carbonsäure als Methylester hatte ebenfalls keinen Einfluss auf die bakterielle Pyocyaninproduktion.

Aus dem strukturbasierten PhzF-Ligandendesign dieser Arbeit wurden Details der PhzF-Bindetasche und Struktur-Aktivitätsbeziehungen der Liganden gewonnen, die eine rationale Grundlage bieten, die gefundenen Strukturen zu PhzF-Inhibitoren als Pathoblocker für P. aeruginosa weiterzuentwickeln.