Enzyme-free magnetic diagnostics circuit for detection of SARS-CoV-2 RNA
The detection of nucleic acids has gained enormous attention due to their potential as disease biomarkers. However, deoxy-/ribonucleic acids (DNA/RNA) detection often requires extensive and costly sample processing, including extraction and enzyme-based amplification. Magnetic assays based on magnetic nanoparticles (MNPs) and Magnetic Particle Spectroscopy (MPS) show great potential for mix-and-measure detection as the magnetic signal of MNPs does not interfere with the typical magnetic signal of biological background, making MNPs detectable even in opaque sample media. Moreover, portable MPS devices make magnetic assays adaptable for point-of-care applications. By realizing magnetic assays amplification- and enzyme-free, they will become irreplaceable for point-of-care diagnostics.
Generally speaking, the binding of molecules to the surface of MNPs increases the hydrodynamic size of the particles, which in turn increases the Brownian relaxation time constant. The change in particle’s relaxation can be readout using MPS. This thesis comprises the development of magnetic assays for the detection of pathogen specific RNA, which are based on target-induced declustering events of responsive magnetic clusters. The declustering-approach makes use of toehold-mediated DNA strand displacement reactions. Upon the addition of target, the clusters are dissociated into their building block MNPs, which reduces their initial hydrodynamic size and results in an increase of the MPS signal. By exploiting DNA nanotechnology methods and nanoswitches, a Magnetic signal Amplification Circuit (MAC) was developed to further amplify the magnetic signal, improving the assay sensitivity by a factor of four. In order to enable whole genome detection, the assay was evolved into the initiated MAC assay. It is demonstrated that the initiated MAC assay is capable of detecting the whole RNA genome of cell culture-grown Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) samples in a one-pot, amplificationand enzyme-free fashion at isothermal conditions (25 °C). For comparison, the extracted RNA elutions were analyzed by polymerase chain reaction and cycle thresholds of up to 26 were determined. Furthermore, it is shown how the initiated MAC can reliably discriminate between SARS-CoV-2 and other human coronaviruses. Finally, a cost analysis was performed to evaluate the resource efficiency of the approach. Conclusively, the declustering-based MAC assays introduce a whole new approach for MPS-based magnetic assays, enhancing their competitiveness among other detection platforms.
In der labormedizinischen Diagnostik gewinnen Nukleinsäuren zunehmend an Bedeutung, da sie zur Früherkennung von Krankheiten beitragen. Der Nachweis von pathogenspezifischer Desoxy-/Ribonukleinsäure (DNA/RNA) erfordert jedoch häufig eine umfangreiche und kostenintensive Probenpräparation, einschließlich Extraktion und enzymbasierter Amplifikation. Magnetische Assays, die auf magnetischen Nanopartikeln (MNP) und der Magnetischen Partikelspektroskopie (MPS) basieren, bieten großes Potenzial für den Nachweis von Pathogenen ohne vorherige Aufbereitung der Proben. Das magnetische Signal der MNP interferiert nicht mit dem typischen Signal des biologischen Hintergrunds, wodurch die Detektion von MNP auch in undurchsichtigen Probenmedien möglich ist. Darüber hinaus ermöglicht die Entwicklung von portablen MPS-Geräten den Einsatz direkt am Point-Of-Care.
Im Allgemeinen vergrößert die Bindung von Molekülen an MNP deren hydrodynamisches Volumen, wodurch die Brown’sche Relaxationszeitkonstante der Partikel erhöht wird. Diese Änderung in der Relaxation kann mithilfe der MPS detektiert werden. Diese Arbeit umfasst die Entwicklung eines Nachweisverfahrens zur Detektion von pathogener RNA, welches auf Target-induzierten Declustering-Prozessen von reaktiven magnetischen Clustern basiert. Die Auflösung der Cluster erfolgt durch die Toehold-vermittelte DNA-Strangverdrängung. Spezifische Zielsequenzen binden an funktionelle Gruppen der Cluster und zerlegen diese sukzessive in ihre Grundbausteine, die einzelnen MNP. Im Gegensatz zum herkömmlichen Clustering-Ansatz wird hier das initiale hydrodynamische Volumen der Cluster reduziert, wodurch die Relaxationszeit verkürzt und das MPS-Signal verstärkt wird. Unter Zuhilfenahme verschiedener Methoden der DNA-Nanotechnologie wurde eine Verstärkerschaltung auf molekularer Ebene aufgebaut, welche als Magnetic signal Amplification Circuit (MAC) bezeichnet wird. Durch den Einsatz des MAC-Assays konnte die Sensitivität der untersuchten Assays um das Vierfache verbessert werden. Für die Detektion ganzer RNA-Genome musste die Schaltung um eine vorhergehende Initiierung erweitert werden. Es wird gezeigt, dass initiierte MAC-Assays in der Lage sind, das vollständige RNA-Genom von in Zellkultur gezüchteten Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Proben nachzuweisen.
Dies geschieht in einer Ein-Topf-Reaktion, ohne den Einsatz von Enzymen und unter isothermen Bedingungen (25 °C). Zum Vergleich der Sensitivität wurden Polymerase-Kettenreaktionen an denselben Elutionen durchgeführt und es wurden Zyklusschwellenwerte von bis zu 26 ermittelt. Darüber hinaus wird gezeigt, dass initiierte MAC-Assays SARS-CoV-2 von anderen humanen Coronaviren unterscheiden können. Zuletzt wurde eine Kostenanalyse durchgeführt, um die Wirtschaftlichkeit der Assays zu demonstrieren. Die hier entwickelten MAC-Assays eröffnen einen völlig neuen Ansatz für MPS-basierte magnetische Assays und erhöhen die Konkurrenzfähigkeit gegenüber anderen Detektionsplattformen erheblich.
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