Homogene Immunoassays zur empfindlichen Virusdetektion mit magnetischen Nanopartikeln
Magnetische Nanopartikel (MNP) bieten vielfältige Anwendungsmöglichkeiten in der medizinischen Therapie und Diagnostik. Diese Arbeit fokussiert sich auf die Virusdetektion über Immunoassays mit MNP. Dabei wird die Partikelhülle mit Antikörpern gegen das Virus funktionalisiert. Bindet das Virus an die Antikörper, wird das Partikel größer und es verändern sich dessen magnetische Eigenschaften. Durch den magnetischen Partikelkern richten sich MNP nach einem externen Magnetfeld aus. Für Immunoassays ist die Brown-Relaxation relevant, die von der hydrodynamischen Größe des Partikels abhängt. Je größer die Partikel sind, umso langsamer folgen diese einem magnetischen Wechselfeld. Dies kann über magnetische Messmethoden detektiert werden, wobei die magnetische Partikelspektroskopie (MPS) aufgrund des schnellen Messprinzips besonders interessant ist. In dieser Arbeit wird das „ImmunoMPS“ genutzt, welches speziell für Messungen mit BNF-Partikeln der Firma micromod bei 590 Hz ausgelegt ist.
Für verlässliche Virusdetektion ist es wichtig, die Eigenschaften und das Verhalten der Partikel zu kennen. Die hier verwendeten Partikel besitzen einen Multikern, womit sich die magnetischen Momente vieler Kristallite zu einem effektiven magnetischen Partikelmoment meff überlagern. Die Feldabhängigkeit von meff wird über Wechselfeldsuszeptometriemessungen untersucht. Es wird gezeigt, dass die Feldabhängigkeit entsprechend der Packungsdichte und Wechselwirkungen der Kristallite im Kern variiert. Darüber hinaus werden zwei Methoden zur Bestimmung der temperaturabhängigen Anisotropiekonstanten K(T) analysiert. Beide Methoden basieren auf der Erweiterung des Stoner-Wohlfarth-Modells um Temperatureinflüsse und nutzen die Magnetisierungskurven bei verschiedenen Temperaturen. Es wird beobachtet, dass die Anisotropiekonstante mit steigender Temperatur sinkt. Für beide Methoden zeigt sich eine übereinstimmung der Werte, allerdings nur bei Berücksichtigung der Größenverteilung der Partikel.
In dieser Arbeit wird ein Immunoassay zur Detektion des intakten SARS-CoV-2 optimiert. Sowohl Virus als auch Partikel besitzen mehrere Bindungsstellen, wodurch Vernetzungen zwischen diesen entstehen und das Bindungsverhalten komplexer wird. Messungen ergeben, dass ein Verhältnis von Virus- zu Partikelanzahl von 0,5 bis 2 die höchste Empfindlichkeit des Nachweises aufweist. Darüber hinaus zeigen Untersuchungen der Funktionalisierung der Antikörper über Protein A an der Partikelhülle, dass 1,6 Antikörper pro Protein A optimal sind. Positiv wirkt sich ein Waschprozess zur Entfernung ungebundener Antikörper aus. Dadurch werden zusätzlich fehlerhaft funktionalisierte Partikel entfernt. Bezüglich der Inkubationsbedingungen ergibt sich die höchste Empfindlichkeit bei niedrigeren Temperaturen um 5 °C und Inkubation in der Zentrifuge. Bei geringen Drehzahlen werden Virus und Partikel näher zusammengebracht. Mit den optimierten Parametern des Immunoassays wird eine Nachweisgrenze von 0,208 pM erreicht, wobei weitere Verbesserungsmöglichkeiten diskutiert werden.
Magnetic nanoparticles (MNP) offer a wide range of potential applications in medical therapy and diagnostics. This work focuses on virus detection using immunoassays with MNP. The particle shell is functionalized with antibodies against the virus. When the virus binds to the antibodies, the particle becomes larger and its magnetic properties change. Due to the magnetic particle core, MNP align with an external magnetic field. For immunoassays the process of Brownian relaxation is relevant, because it depends on the hydrodynamic size of the particle. The larger the particles are, the slower they follow an alternating magnetic field. This can be detected using magnetic measurement methods, whereby magnetic particle spectroscopy (MPS) is particularly interesting due to the fast measurement principle. In this work, the ’ImmunoMPS’ is used, which is specially designed for measurements with BNF particles from micromod at 590 Hz. For reliable virus detection, it is important to know the properties and behavior of the particles. The particles used here have a multicore, which means that the magnetic moments of many crystallites overlap to form an effective magnetic particle moment meff. The field dependence of meff is investigated using alternating field susceptometry measurements. It is shown that the field dependence varies according to the packing density and interactions of the crystallites in the core. Furthermore, two methods for the determination of the temperature-dependent anisotropy constant K(T) are analyzed. Both methods are based on the extension of the Stoner-Wohlfarth model by temperature influences and use the magnetization curves at different temperatures. It is observed that the anisotropy constant decreases with increasing temperature. Both methods agree only when the size distribution of the particles is taken into account In this work, an immunoassay for the detection of intact SARS-CoV-2 is optimized. Both virus and particles have multiple binding sites, resulting in cross-linking between them and making the binding behavior more complex. Measurements show that a virus-to-particle ratio of 0.5 to 2 has the highest sensitivity of detection. In addition, studies of the functionalization of the antibodies with protein A on the particle shell show that 1.6 antibodies per protein A are optimal. A washing process to remove unbound antibodies has a positive effect. Besides antibodies, it also removes incorrectly functionalized particles. With regard to the incubation conditions, the highest sensitivity of the detection method is achieved at low temperatures around 5 °C and incubation in the centrifuge. At low speeds, virus and particles are brought closer together. With the optimized parameters of the immunoassay, a detection limit of 0.208 pM is achieved, whereby further possibilities for improvement are discussed.
Preview
Cite
Access Statistic
Rights
Use and reproduction:
All rights reserved