Structural and biochemical characterization of PhzF-like isomerases in Pseudomonas aeruginosa PA14
P. aeruginosa is an opportunistic pathogen that causes severe infections in cystic fibrosis and immunocompromised patients. Due to its resistance against many classes of antibiotics, adequate treatment of those patients is very difficult. This circumstance urges researchers to find target structures in P. aeruginosa and develop new antibacterial compounds. One class of putative drug targets are isomerases with a similar protein fold as PhzF. PhzF and PhzF-like isomerases are often involved in important metabolic pathways such as phenazine biosynthesis, lysine biosynthesis, proline or energy metabolism. In this study, the PhzF-like isomerase genes and proteins PA14_46630, PA14_62410, PA14_28280 and PA14_18020, without associated function, were investigated with X-ray crystallography, biochemical and biological methods. Additionally, the diaminopimelate epimerase PA14_69690 and hydroxyproline epimerase PA14_47840 were investigated with similar methods. The structural analysis for PA14_46630, PA14_62410, PA14_28280 and PA14_18020 revealed for all four proteins an active site with residues very similar to PhzF, enabling them to accept and convert the PhzF substrate (2S,3S)-2,3-dihydro-3-hydroxyanthranilic acid. However, no complex structure with the substrate was obtained. Deleting the gene PA14_46630 in P. aeruginosa, a change in colony morphology was observed on agar plates, but the conducted metabolic and transcriptomic analysis could not explain this observation. Furthermore, an impact on P. aeruginosa virulence or growth was not found for any of these genes in growth studies and Galleria mellonella assays. Even if no specific function could be annotated to these genes and proteins, the results acquired in this work provide starting points for future follow-up studies. For the diaminopimelate epimerase PA14_69690, a crystal structure in the open conformation was obtained and kinetic and thermal stability experiments were performed. Complex crystal structures of the hydroxyproline epimerase PA14_47840 with proline analogues in the active site provide a deeper insight into the ligand binding mode. Additionally, an assay investigating the substrate spectrum of the hydroxyproline epimerase revealed that it is not strictly limited to hydroxyprolines. Altogether, the information provided here about diaminopimelate epimerase PA14_69690 and hydroxyproline epimerase PA14_47840 help to complete the knowledge about these proteins. Determined crystal structures may serve as templates for drug design and help to combat antibiotic resistance of the nosocomial pathogen P. aeruginosa.
P. aeruginosa ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der schwere Infektionen bei immunsupprimierten Menschen oder Patienten mit zystischer Fibrose verursacht. Aufgrund seiner zahlreichen Resistenzmechanismen gegen nahezu alle Antibiotika gestaltet sich die Behandlung von Patienten äußerst schwierig. Aus diesem Grund ist es wichtig, neue Zielstrukturen in P. aeruginosa zu identifizieren und entsprechende antibakterielle Substanzen zu entwickeln. Eine Klasse solcher möglichen Zielstrukturen sind Isomerasen mit einer ähnlichen Proteinstruktur wie PhzF. Diese sogenannten PhzF-artigen Isomerasen und PhzF selbst sind häufig an wichtigen metabolischen Prozessen und Biosynthesewegen beteiligt, wie zum Beispiel der Phenazinbiosynthese, Lysinbiosynthese, Prolinmetabolismus oder der Energiegewinnung. In dieser Arbeit wurden daher die PhzF-artigen Isomerasen PA14_46630, PA14_62410, PA14_28280 und PA14_18020 ohne bekannte Funktion mit verschiedenen biochemischen, biologischen und röntgenkristallographischen Methoden charakterisiert. Zusätzlich wurden auch die Diaminopimelat-Epimerase und die Hydroxyprolin-Epimerase mit ähnlichen Methoden untersucht. Die Strukturanalyse von PA14_46630, PA14_62410, PA14_28280 und PA14_18020 zeigte für alle vier Proteine ein ähnliches aktives Zentrum wie das von PhzF. Dies ermöglicht es den Proteinen, das PhzF-Substrat (2S,3S)-2,3-Dihydro-3-hydroxyanthranilsäure zu binden und umzusetzen. Eine Komplexstruktur mit dem Substrat konnte jedoch nicht aufgeklärt werden. Nach Entfernen des PA14_46630-Gens in P. aeruginosa wurde eine Veränderung der Koloniemorphologie beobachtet, die jedoch nicht eindeutig durch eine Metabolom- und Transkiptomanalyse erklärt werden konnte. Ein Einfluss von PA14_46630 oder den anderen unbekannten Genen auf die Virulenz oder das Wachstum wurde in Galleria mellonella- und entsprechenden Wachstumsexperimenten nicht beobachtet. Auch wenn den Proteinen in dieser Arbeit keine genaue Funktion oder ein Substrat zugeordnet werden konnte, liefern die erworbenen Erkenntnisse hilfreiche Informationen für nachfolgende Studien. Für die Diaminopimelat-Epimerase wurden neben enzymkinetischen Parametern und thermischen Stabilität auch eine Kristallstruktur in offener Konformation aufgeklärt. Für die Hydroxyprolin-Epimerase wurden Aktivitätsexperimente und thermische Stabilitätstests mit unterschiedlichen Prolinanaloga durchgeführt. Die aufgeklärten Proteinstrukturen mit verschiedenen Prolinanaloga im aktiven Zentrum tragen dazu bei, die Bindungsweise und das Substratspektrum zu verstehen. Hierbei wurde auch festgestellt, dass das Substratspektrum nicht ausschließlich auf Hydroxyproline beschränkt ist. Die gemachten Ergebnisse zur Diaminopimelat-Epimerase PA14_69690 und der Hydroxyprolin Epimerase PA14_47840 tragen zum besseren Verständnis dieser Proteine bei und können bei der Entwicklung neuer Substanzen helfen, um das Resistenzproblem von P. aeruginosa zu überwinden.
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