Discovery of novel MR1-dependent MAIT cell responses in infections.

Jakob, Josefine

doi:10.24355/dbbs.084-202411271410-0

Thesis Wed Nov 27 2024 CC BY-NC-SA 4.0

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Discovery of novel MR1-dependent MAIT cell responses in infections.

Jakob, Josefine

English
German

Mucosal-associated invariant T (MAIT) cells are multifunctional effector cells recognizing MR1-binding metabolites. This MR1 pathway remains, despite numerous studies, incompletely understood regarding activation and induction of immune responses and was therefore further investigated in this doctoral thesis. Although the activation of MAIT cells was originally only associated with bacterial riboflavin derivatives, increasing evidence points to an MR1-dependent activation of MAIT cells in the presence of various molecules including self-antigens. Recently, the Clostridioides difficile (C. difficile)-derived toxin CDT was shown to promote MAIT cell cytotoxicity in an MR1-dependent manner, indicating a non-canonical activation of MAIT cells by CDT. In this doctoral thesis, the underlying mechanism was now specified. The substrate binding and pore-forming subunit CDTb was found sufficient to provoke MAIT cell activation in absence of the enzymatic component CDTa. Moreover, CDT stimulation of monocytes in a bicellular system with MAIT cells increased MAIT cell activation and cytotoxicity. Importantly, this activation was dependent on MR1 presentation. To further understand MR1-mediated immune responses of MAIT cells and monocytes upon antigen stimulation, a translatome study based on Bio-orthogonal non-canonical amino acid tagging (BONCAT) and ultrasensitive proteomics was established (BONCAT proteomics). MAIT cells and THP-1 monocytes were co-cultured and stimulated with the MR1-binding MAIT cell-activating metabolite 5-OP-RU as well as the inhibitory MR1 ligand Ac-6-FP. This bicellular stimulation allowed for the first time the comprehensive investigation of antigen-induced MAIT cell responses at the protein level and the first omics characterization of MAIT-interacting cells. Over 2,000 MAIT and 3,000 THP-1 active protein translations were identified by mass spectrometry following MR1 stimulation. Conjugation frequencies as well as translation were strongly increased only upon 5-OP-RU but not Ac-6-FP stimulation. Ac-6-FP regulated the protein translations of GSK3B, ADAM10, or MIF in MAIT cells, which indicated the induction of an anergic phenotype. In contrast, 5-OP-RU promoted a pro-inflammatory translatome profile in MAIT and THP-1 cells. Next to known effector responses, a distinct type I and type II Interferon-driven translatome profile was uncovered in both cell types following 5-OP-RU stimulation. Consequently, the translatome data indicated that MR1-activated MAIT cells facilitate an M1 polarization of monocytes. This phenotype was confirmed by gene and surface expression profiles of CXCL10, IL-1, CD80, and CD206. Most interestingly, the M1 polarization and Interferon-driven translatome were accompanied by the induction of an antiviral phenotype in THP-1 cells, which suppressed viral replication upon conjugation with MR1-activated MAIT cells. Thus, translatomics revealed that MR1-activated MAIT cells do not only possess anti-bacterial but also anti-viral functions and directly influence the phenotype of monocytes. In the further course of the doctoral thesis, the same BONCAT-based approach was then used to identify known and new effector proteins secreted by MAIT cells with high selectivity. Notably, several tissue repair-associated molecules were identified to be secreted independently from MR1 stimulation, including THBS1, VTN, or PLG. This indicates a pro-regenerative function of MAIT cells in the maintenance of tissue homeostasis, changing phenotypically and functionally during infection.
In the last part of this thesis, the regulation of MR1-dependent MAIT cell responses was investigated by analyzing the role of CD26, which was considered a MAIT cell marker before. CD26 co-stimulation along MR1/ T cell receptor (TCR)-dependent engagement of MAIT cells was found to promote the release of cytotoxic effector molecules, suggesting CD26 as an important mechanism to control MR1-dependent MAIT cell degranulation. CD26-dependent cytotoxicity was also observed upon co-stimulation with the MERS-CoV Spike protein, whereas MAIT cells were resistant to MERS-CoV infection. This implies that MAIT cell activity during infection may be directly modulated by CD26-targeted pathogens. Although pathogen binding to CD26 could thus directly promote the killing of infected cells, it also suggests that the cytotoxicity of MAIT cells must be tightly regulated during inflammation to prevent tissue damage.
In conclusion, four novel MR1-dependent mechanisms were discovered in this thesis:
i. The non-canonical MR1-dependent activation of MAIT cells following CDT stimulation is mediated by monocytes.
ii. Using BONCAT proteomics MR1-activated MAIT cells were found to elevate their global protein translation and to support the induction of an M1 and antiviral phenotype in MAIT-interacting monocytes.
iii. MAIT cells secrete wound healing-associated candidates especially in the absence of TCR stimulation, suggesting a novel bystander function of the cells in tissue.
iv. MR1-dependent MAIT cell cytotoxicity can be modulated by the abundant co-stimulatory and MERS-CoV-interacting molecule CD26.

Mukosal-assoziierte invariante T (MAIT)-Zellen sind multifunktionale Effektorzellen, die MR1-bindende Metaboliten erkennen. Dieser MR1-Signalweg ist trotz zahlreicher Studien in Bezug auf die Aktivierung und Induktion von Immunantworten noch immer unvollständig verstanden und wurde daher in dieser Doktorarbeit weiter untersucht. Obwohl die Aktivierung von MAIT-Zellen ursprünglich nur mit bakteriellen Riboflavinderivaten in Verbindung gebracht wurde, mehren sich die Hinweise auf eine MR1-abhängige Aktivierung von MAIT-Zellen in Gegenwart verschiedenster Moleküle, einschließlich Selbstantigenen. Kürzlich wurde gezeigt, dass das von Clostridioides difficile (C. difficile) stammende Toxin CDT die Zytotoxizität von MAIT-Zellen MR1-abhängig induziert, was auf eine nicht-kanonische Aktivierung von MAIT-Zellen durch CDT hinweist. In dieser Doktorarbeit wurde nun der zugrunde liegende Mechanismus spezifiziert. Es wurde festgestellt, dass die substratbindende und porenbildende Untereinheit CDTb alleine die Aktivierung von MAIT-Zellen bewirken kann, selbst wenn die enzymatische Komponente CDTa fehlt. Darüber hinaus konnte eine Aktivierung und Zytotoxizität der MAIT-Zellen durch CDT-Stimulation in einem bizellulären System mit Monozyten erreicht werden. Hierbei war auch in dem bizellulären System die Aktivierung von der MR1-Präsentation abhängig. Um die MR1-vermittelten Immunantworten von MAIT-Zellen und Monozyten nach Antigenstimulation besser zu verstehen, wurde eine Translatomstudie auf der Grundlage von des bio-orthogonalen nicht-kanonischen Aminosäure-Taggings (BONCAT) und ultrasensitiver Proteomik (BONCAT-Proteomik) durchgeführt. MAIT-Zellen und THP-1-Monozyten wurden gemeinsam kultiviert und mit dem MR1-Metaboliten 5-OP-RU, der MAIT-Zellen aktiviert, sowie dem antagonistischen MR1-Liganden Ac-6-FP stimuliert. Diese bizelluläre Stimulation ermöglichte erstmals eine umfassende Untersuchung der antigen-induzierten MAIT-Zellantworten auf Proteinebene und die erste Omics-Charakterisierung von MAIT-interagierenden Zellen. Über 2.000 MAIT- und 3.000 THP-1-aktive Proteintranslationen wurden nach MR1-Stimulation durch Massenspektrometrie identifiziert. Sowohl die Konjugationshäufigkeit als auch die Translation waren nur bei 5-OP-RU, nicht aber bei Ac-6-FP-Stimulation stark erhöht. Ac-6-FP regulierte die Proteintranslation von GSK3B, ADAM10 oder MIF in MAIT-Zellen, was auf die Induktion eines anergischen Phänotyps hindeutet. Im Gegensatz dazu förderte 5-OP-RU ein pro-inflammatorisches Translatom-Profil in MAIT- und THP-1-Zellen. Neben den bekannten Effektorantworten wurde in beiden Zelltypen nach 5-OP-RU-Stimulation ein ausgeprägtes Typ-I- und Typ-II-Interferon-induziertes Translatomprofil identifiziert. Folglich deuteten die Translatomdaten darauf hin, dass MR1-aktivierte MAIT-Zellen eine M1-Polarisierung von Monozyten fördern. Dieser Phänotyp wurde durch Gen- und Oberflächenexpressionsprofile von CXCL10, IL-1, CD80 und CD206 bestätigt. Interessanterweise gingen die M1-Polarisierung und das Interferon-getriebene Translatom mit der Induktion eines antiviralen Phänotyps in THP-1-Zellen einher, die nach Konjugation mit
MR1-aktivierten MAIT-Zellen die virale Replikation unterdrückten. Die Translatom-Analyse zeigte also, dass MR1-aktivierte MAIT-Zellen nicht nur antibakterielle, sondern auch antivirale Funktionen besitzen und den Phänotyp von Monozyten direkt beeinflussen. Im weiteren Verlauf der Doktorarbeit wurde dann der gleiche BONCAT-basierte Ansatz verwendet, um bekannte und neue Effektorproteine zu identifizieren, die von MAIT-Zellen mit hoher Selektivität sezerniert werden. Insbesondere wurden mehrere mit der Gewebereparatur assoziierte Moleküle identifiziert, die unabhängig von der MR1-Stimulation sezerniert wurden, darunter THBS1, VTN oder PLG. Dies deutet auf eine pro-regenerative Funktion der MAIT-Zellen bei der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase hin, die sich während der Infektion phänotypisch und funktionell verändert.
Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Regulierbarkeit von MR1-abhängigen MAIT-Zellantworten untersucht, indem die Rolle von CD26 analysiert wurde, ein Rezeptor, der zuvor als MAIT-Zellmarker vorgeschlagen wurde. Es wurde festgestellt, dass die Co-Stimulation von CD26 bei einer MR1/T-Zellrezeptor (TZR)-abhängiger Aktivierung von MAIT-Zellen die Freisetzung zytotoxischer Effektormoleküle fördert, was darauf hindeutet, dass CD26 ein wichtiger Mechanismus zur Kontrolle der MR1-abhängigen MAIT-Zelldegranulation ist. Diese CD26-abhängige Zytotoxizität wurde auch bei TZR Co-Stimulation mit dem MERS-CoV-Spike-Protein beobachtet, während MAIT-Zellen gegen eine MERS-CoV-Infektion resistent waren. Dies lässt vermuten, dass die Aktivität der MAIT-Zellen während der Infektion direkt durch CD26-gerichtete Krankheitserreger moduliert werden kann. Obwohl die Bindung des Erregers an CD26 somit direkt die Abtötung infizierter Zellen fördern könnte, zeigt dies auch, dass die Zytotoxizität der MAIT-Zellen während der Infektion streng reguliert werden muss, um Gewebeschäden zu verhindern.
Zusammenfassend konnten also vier neue MR1-abhängige Mechanismen in dieser Dissertation gezeigt werden:
i. Die CDT-induzierte nicht-kanonische Aktivierung von MAIT-Zellen wird durch Monozyten vermittelt, die die MR1-Oberflächenexpression hochregulieren.
ii. Mithilfe der BONCAT-Proteomik wurde festgestellt, dass MR1-aktivierte MAIT-Zellen ihre globale Proteintranslation erhöhen und die Induktion eines M1- und antiviralen Phänotyps in MAIT-interagierenden Monozyten unterstützen.
iii. MAIT-Zellen sekretieren wundheilungsassoziierte Kandidaten, insbesondere in Abwesenheit von TCR-Stimulation, was auf eine neuartige Homöostase-Funktion der Zellen im Gewebe hindeutet.
iv. Die MR1-abhängige Zytotoxizität der MAIT-Zellen kann durch das co-stimulatorische und mit MERS-CoV interagierende Oberflächenprotein CD26 verstärkt werden.