Structure and Assembly of the Proline Reductase Complex from Clostridioides difficile
The pathogenic bacterium Clostridioides difficile has become a significant healthcare concern. The pathogenicity of this bacterium is connected to its highly adaptive metabolism.
This study aimed to elucidate the structure and assembly of the D-proline reductase complex (Prd), a pivotal enzyme in Stickland fermentation, comprising the pyruvoyl-dependent PrdA and the selenocysteine-containing PrdB.
Throughout this research, a novel enzyme mediating the maturation of PrdA was discovered and named PrdH. It was demonstrated that this maturation requires the PrdB subunit, despite the ability of PrdH to interact solely with PrdA. Detailed analysis of this processing reaction revealed the enzymatic nature of PrdH. Successful in vitro catalysis of D-proline reduction was achieved by incorporating selenocysteine into recombinantly expressed PrdB, producing a functional enzyme. Mutagenesis of PrdA and PrdH elucidated critical amino acids and revealed interaction dynamics, notably identifying arginine at position 32 in PrdH as crucial for both interaction with PrdA and mediation of the processing reaction. The interaction between PrdA and PrdH was found to be transient, with PrdH detaching after the processing reaction. However, an active site mutant of PrdA facilitated the capture of a bound PrdA/PrdH complex, offering prospects for future structural studies.
The crystal structure of PrdD/PrdE, two pseudoenzymes resembling the catalytic domain of PrdA, was solved, providing initial structural insights into a Prd-related protein. To further investigate the D-proline reductase, challenges related to denaturation and aggregation of full length PrdA during recombinant expression were overcome through co-expression with prdB and prdH. This approach suggested that the maturation of PrdA is a prerequisite for correct assembly of the complex.
The recombinantly expressed complex was suitable for further structural studies through negative-stain TEM and single particle analysis via cryo-EM, leading to the resolution of a processed, heterohexameric PrdA/PrdB complex. This work has illuminated various structural and functional aspects of the D-proline reductase complex, revealing it as an intricately dynamic system. By unraveling its maturation and assembly processes, this study contributes to a deeper understanding of this critical enzyme in the metabolism of C. difficile.
Das pathogene Bakterium Clostridioides difficile ist zu einem bedeutenden Problem des Gesundheitssystems geworden.
Die Pathogenität des Bakteriums steht dabei in enger Verbindung zu seinem adaptiven Metabolismus.
Das Ziel dieser Dissertation war die Aufklärung der Struktur und Assemblierung des D-Prolin-Reduktase-Komplexes (Prd), eines wichtigen Enzyms innerhalb der Stickland-Fermentation, zusammengesetzt aus dem pyruvoyl-abhängigen PrdA und dem Selenocysteine-enthaltenden PrdB.
Im Verlauf der Arbeit konnte ein neuartiges Enzym entdeckt werden, welches die Reifung von PrdA vermittelt und als PrdH benannt wurde. Es konnte gezeigt werden, dass diese Reifung die PrdB-Untereinheit benötigt, obwohl PrdH unabhängig davon mit PrdA interagieren kann. Weiterführende Untersuchungen des Prozesses zeigten, dass PrdH als Enzym fungiert. Durch den Einbau von Selenocysteine in PrdB konnte eine funktionale D-Prolin-Reduktase erzeugt und die erfolgreiche in vitro-Katalyse der D-Prolin-Reduktion erreicht werden.
Durch Mutagenese von PrdA und PrdH wurden wichtige Aminosäuren identifiziert und Interaktionsdynamiken aufgeklärt. Insbesondere Arginin an Position 32 in PrdH konnte als essentiell sowohl für die Interaktion mit PrdA als auch für die Induzierung der Prozessierungsreaktion bestimmt werden. Es wurde festgestellt, dass die Interaktion zwischen PrdA und PrdH transient ist, wobei sich PrdH nach der Reaktion von PrdA löst. Eine Mutagenese im aktiven Zentrum von PrdA ermöglichte jedoch die Erzeugung eines gebundenden PrdA/PrdH-Komplexes und bietet Möglichkeiten für zukünftige strukturelle Untersuchungen. Die Kristallstruktur von PrdD/PrdE, zwei Pseudoenzymen, die homolog zu der katalytischen Domäne von PrdA sind, konnte gelöst werden und bietet erste Einblicke in die Struktur eines Prd-Proteins. Um den D-Prolin-Reduktase-Komplex weiter zu untersuchen, wurden Schwierigkeiten bei der rekombinanten Expression von Gesamtlängen-prdA in Form von Denaturierung und Aggregation durch Koexpression mit prdB und prdH gelöst. Daraus konnte geschlossen werden, dass die Reifung von PrdA eine Voraussetzung für die korrekte Assemblierung des Komplexes ist. Dieser rekombinant exprimierte Komplex wurde für weitergehende strukturelle Untersuchungen mittels Negativkontrast-TEM und Einzelpartikelanalyse via Kryo-EM genutzt, was zur Auflösung eines prozessierten, heterohexameren PrdA/PrdB-Komplexes führte.
Diese Dissertation hat verschiedene strukturelle und funktionelle Aspekte des D-Prolin-Reduktase-Komplexes beleuchtet, welcher sich als ein sehr dynamisches System herausstellte. Indem Reifungs- und Assemblierungsprozesse aufgeklärt wurden, leistet diese Arbeit einen Beitrag zum tieferen Verständnis dieses wichtigen Enzyms im Stoffwechsel von C.difficile.
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