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Raloxifenbasierte PhzB-Liganden als potentielle Pseudomonas aeruginosa-Antiinfektiva

ORCID
0009-0005-8293-7255
Affiliation/Institute
Institut für Medizinische und Pharmazeutische Chemie
Zimmermann, Moritz

Die Zunahme der mikrobakteriellen Resistenz gegen Antibiotika ist eine große Belastung für das globale Gesundheitssystem und erfordert neuartige Therapiekonzepte. Der Ansatz der Virulenzfaktorinhibition hat zum Ziel, die Schädlichkeit eines Pathogens zu verringern, ohne es dabei abzutöten und so die Entwicklung von Resistenzen zu verlangsamen. Das oppurtunistische Humanpathogen Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) produziert eine Vielzahl von Virulenzfaktoren, darunter das Phenazin Pyocyanin. Pyocyanin spielt unter anderem eine wichtige Rolle bei der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und Biofilmen. Das Phenzinbiosyntheseenzym PhzB katalysiert die zweifache Kondensation eines Aminoketons zu einem Pyocyaninvorläufer. Zwar ist PhzB nicht essentiell für diesen Prozess, steigert die Effizienz in vivo jedoch deutlich. Es stellt daher eine attraktive Zielstruktur zur Entwicklung von Pyocyanininhibitoren dar. Umfassende Untersuchungen zur Entwicklung von PhzB-Inhibitoren mündeten bisher in Molekülen mit hohen Affinitäten für das isolierte Enzym aber unzureichender Pyocyaninreduktion im Zellmodell.

Ho Sui et al. identifizierten den selektiven Estrogenrezeptormodulator Raloxifen in einem drug‑repurposing-Ansatz als möglichen Inhibitor von PhzB. Raloxifen reduzierte die Pyocyaninreduktion in P. aeruginosa und  verlängerte das Überleben von C. elegans in einem Infektionsmodell. Ausgehend von der in vorherigen Arbeiten erhaltenen Kokristallstruktur von Raloxifen mit BcPhzB wurden in der vorliegenden Arbeit in einem strukturbasierten Ansatz Raloxifenanaloga entwickelt. Die erhaltenen Substanzen wurden mittels biophysikalischer, biochemischer und röntgenkristallographischer Methoden umfassend charakterisiert. Dabei wurden mittels isothermer nano differential scanning fluorimetry und isothermer Titrationskalorimetrie Affinitäten zum PhzB-Ortoholog aus B. cepacia im unteren mikromolaren Bereich ermittelt. Verglichen mit der Ausgangssubstanz Raloxifen zeigten die entwickelten PhzB‑Liganden eine signifikant stärkere Inhibition der Pyocyaninproduktion in P. aeruginosa PA14. Durch Substitution der Hydroxylgruppen des Benzo[b]thiophengrundkörpers wurde des Weiteren die Affinität gegenüber dem humanen Estrogenrezeptor gesenkt und so eine Strategie zur weiteren Verbesserung der Selektvität in zukünftigen Studien erarbeitet. Die zahlreichen erhaltenen Kokristallstrukturen der Liganden gaben Aufschluss über ihren Bindungsmodus und liefern Anhaltspunkte für das rationale Strukturdesign von weiteren Analoga.

The increase in microbacterial resistance to antibiotics is a major burden for the global healthcare system and requires novel therapeutic concepts. The concept of virulence factor inhibition aims to reduce the harmfulness of a pathogen without killing it and thus slowing down the development of resistance. The oppurtunistic human pathogen Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) produces a variety of virulence factors, including the phenazine pyocyanin. Among other effects, pyocyanin plays an important role in the generation of reactive oxygen species and formation of biofilms. The phenazine biosynthesis enzyme PhzB catalyses the double condensation of an aminoketone into a pyocyanin precursor. Although PhzB is not essential for this process, it significantly increases the efficiency in vivo. It therefore represents an attractive target structure for the development of pyocyanin inhibitors. Extensive studies on the development of PhzB inhibitors have so far resulted in molecules with high affinities for the isolated enzyme but insufficient pyocyanin reduction in P. aeruginosa.

Ho Sui et al. identified the selective estrogen receptor modulator raloxifene as a potential inhibitor of PhzB in a drug-repurposing approach. Raloxifene reduced pyocyanin reduction in P. aeruginosa and prolonged the survival of C. elegans in an infection model. Based on the cocrystal structure of raloxifene with BcPhzB obtained in previous work, raloxifene analogues were developed using a structure-based approach. The compounds were thoroughly characterised using biophysical, biochemical and X-ray crystallographic methods. Using isothermal nano differential scanning fluorimetry and isothermal titration calorimetry, affinities to the PhzB orthologue from B. cepacia were determined in the low micromolar range. Compared to the parent compound raloxifene, the developed PhzB ligands showed a significantly stronger inhibition of pyocyanin production in P. aeruginosa PA14. Furthermore, the affinity towards the human estrogen receptor was reduced by substituting the hydroxyl groups of the benzo[b]thiophene base scaffold, thus providing a strategy to further improve selectivity in future studies. The numerous cocrystal structures of the ligands obtained provided information about their binding mode and guide the rational structural design of further analogues.

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