Investigating orthohantavirus infection at the single cell level
Orthoantaviruses are important zoonotic pathogens causing severe disease burden worldwide. Scientific research with orthohantaviruses is challenging due to the time consuming cultivation and quantification of the viruses under investigation. Simplifying and shortening this process is one of the aims of this thesis. For this purpose, a protocol for flow cytometry as well as a protocol for fluorescence microscopic analysis was established. In particular, the time-consuming evaluation of the microscopic images and the post-processing of the resulting tabular data were considerably shortened by automated processing procedures using existing programmes and newly programmed software. According to current knowledge, orthohantaviruses, which can infect humans, are mainly transmitted by rodents. In order to investigate this host specificity, the goal was to establish a cell model. This model is based on human cells and cells derived from the bank vole, which is the natural reservoir of Puumala virus (PUUV). With this, the host cell tropism of PUUV (Vranica) and Tula virus (TULV Moravia) could be simulated. PUUV infected both, the cells of the human lung and the cells of its host to varying degrees. In contrast, the non-pathogenic TULV strain, whose natural host is the common vole, was hardly able to infect the cells of the model. More in-depth studies on virus entry into the cells revealed cell- and virus-specific differences. Inhibition of macropinocytosis and clathrin-mediated endocytosis led to virus-specific inhibition of infection rates, but no resistance of the cells to the virus. In conclusion, both endocytosis pathways seem to be involved in virus entry. This is supported by phosphoproteomic analyses. In the third and final part of this thesis, the interplay between the cellular Mx protein and the viral nucleocapsid protein (N) was investigated. The aim was to confirm antiviral effects of Mx and elucidate the underlying mechanism. However, this could not be shown beyond doubt in the experiments, so that further establishment steps and other methodological approaches will hopefully provide information in the future.
Orthohantaviren sind wichtige zoonotische Krankheitserreger, die weltweit eine erhebliche Krankheitslast verursachen. Die wissenschaftliche Forschung mit Orthohantaviren erschwert sich durch eine zeitaufwändige Kultivierung und Quantifizierung der zu erforschenden Viren. Dies zu erleichtern und beschleunigen ist eines der Ziele dieser Arbeit. Hierfür wurde sowohl ein Protokoll für Durchflusszytometrie, als auch ein Protokoll für fluoreszenmikroskopische Analysen etabliert. Vor allem die zeitaufwändige Auswertung der mikroskopischen Bildaufnahmen und die Nachbearbeitung der daraus resultierenden tabellarischen Daten wurde durch automatisierte Verarbeitungsprozesse unter Einbeziehung von bereits erwerblichen Programmen, sowie einer neu programmierten Software erheblich verkürzt. Nach derzeitigem Kenntnisstand werden Orthohantaviren, die den Menschen infizieren können, hauptsächlich von Nagern übertragen. Um diese Wirtsspezifität zu untersuchen wurde ein zellbasiertes Modellsystem etabliert. Dieses stützt sich sowohl auf humane Zellen, als auch auf Zellen, die aus der Rötelmaus stammen, die das natürliche Reservoir des Puumala Virus (PUUV) darstellt. Mit diesem Model konnte der Wirtszelltropismus von PUUV (Vranica) und Tula Virus (TULV Moravia) simuliert werden. So infiziert PUUV sowohl die Zellen, die aus der menschlichen Lunge stammen, als auch Zellen seines Wirtes in unterschiedlicher Stärke. Dagegen konnte, der als nicht pathogen zählende TULV Stamm, dessen natürlicher Wirt die Feldmaus ist, kaum Zellen des Models infizieren. Eingehendere Untersuchungen zum Viruseintritts in die Zellen ergab zell-, wie virusspezifische Unterschiede. Eine Hemmung von Makropinozytose und Clathrin-vermittelte Endozytose führte zu einer virusspezfischen Hemmungen der Infektionsraten, allerdings zu keiner Resistenz der Zellen gegen das Virus. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass beide Endozytosewege am Viruseintritt beteiligt zu sein scheinen. Dies wird durch phosphoproteomische Analysen gestützt. Im dritten und letzten Teil dieser Arbeit wurde das Zusammenspiel zwischen dem zellulären Mx-Protein und dem viralen Nukleokapsidprotein (N) untersucht. Ziel war es, die antivirale Wirkung von Mx zu bestätigen und den zugrundeliegenden Mechanismus aufzuklären. Dieser konnte jedoch in den Experimenten nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden, so dass weitere Etablierungsschritte und andere methodische Ansätze in Zukunft hoffentlich Aufschluss geben werden.
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