Sparse transgene expression in zebrafish using self-excisable DNA elements
Zebrafish (Danio rerio) share a high degree of genetic and physiological similarity with humans, which makes them an excellent model for studying human diseases and drug discovery. They are highly prolific and maintained in a small space, making them a cost-effective and efficient model for pharmacological studies. The transparency of zebrafish larvae allows for non-invasive in vivo imaging and single cell studies enable addressing questions of individual cell morphology as well as cell autonomous effects of genetic manipulation. Hence, we developed a single vector system in zebrafish for cell type specific sparse labelling and manipulation of cells using inducible self-excising DNA elements that results in the random activation of one or several transgenes. Recombination of a codon-optimized modified Cre-recombinase (CREM) flanked by lox-sites is driven in cerebellar Purkinje neurons as a model cell type for validating the recombination efficiency. Using variable lox site combinations, recombination frequency can be tuned from 30% to only a few target cells (<5%). Furthermore, chemically or light inducible CREM that are free of background activity offer the possibility to activate transgene expression in single labelled cells with random distribution at a chosen time-point. These systems can be tuned in their inducible recombination efficiency by adjusting the duration of treatment, by altering the concentration or illumination strength, or by varying the activity of regulatory elements. Since all the components of the inducible systems are harbored within the same transgene cassette, any transgene can be rendered inducible by a single cloning step. As an application, we show that this expression system can be used for lineage tracing revealing that cerebellar Purkinje cells are derived from Fabp7 expressing radial glia progenitor cells. Overall, we elucidate a powerful method for random activation of transgene expression in a cell type specific manner in zebrafish using a single vector, inducible and tunable multi-cistron expression unit.
Zebrabärblinge (Danio rerio) weisen ein hohes Maß an genetischer und physiologischer Ähnlichkeit mit dem Menschen auf, was sie zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und die Erforschung von Arzneimitteln macht. Sie sind einfach zu vermehren und können auf kleinem Raum gehalten werden, was sie zu einem kostengünstigen und effizienten Modell für pharmakologische Studien macht. Die Transparenz von Zebrafischlarven ermöglicht nicht-invasive In-vivo-Bildgebung, und durch Einzelzellstudien können Fragen zur Morphologie einzelner Zellen sowie zu zellautonomen Auswirkungen genetischer Manipulationen untersucht werden. Wir haben ein Einzelvektorsystem für Zebrafische entwickelt, das eine zelltypspezifische, spärliche Markierung und Manipulation von Zellen mit Hilfe von induzierbaren, selbstausschneidenden DNA-Elementen ermöglicht, die zu einer zufälligen Aktivierung eines oder mehrerer Transgene führen. Zur Validierung der Rekombinationseffizienz wurde die Rekombination einer Codon-optimierten modifizierten Cre-Rekombinase (CREM), die von lox-Stellen flankiert wird, in Purkinje-Neuronen des Zebrafischkleinhirns als Modellzelltyp durchgeführt. Mit Hilfe variabler lox-Stellenkombinationen kann die Rekombinationshäufigkeit von 30% auf nur wenige Zielzellen (<5%) eingestellt werden. Darüber hinaus bieten chemisch oder durch Licht induzierbare CREM-Systeme, die frei von Hintergrundaktivität sind, die Möglichkeit, die Expression von Transgenen in einzelnen markierten Zellen mit zufälliger Verteilung zu einem bestimmten Zeitpunkt zu aktivieren. Diese Systeme können in ihrer induzierbaren Rekombinationseffizienz durch Anpassung der Behandlungsdauer, durch Änderung der Konzentration oder Beleuchtungsstärke, oder durch Variation der Aktivität der regulatorischen Elemente eingestellt werden. Da alle Komponenten der induzierbaren Systeme in der gleichen Transgenkassette untergebracht sind, kann jedes Transgen durch einen einzigen Klonierungsschritt induzierbar gemacht werden. Als Anwendung zeigen wir, dass dieses Expressionssystem genutzt werden kann, um die genetische Abstammung von Zellen zu verfolgen. So konnten wir nachweisen, dass die Purkinje Neuronen des Kleinhirns aus Fabp7 exprimierenden radialen Glia-Vorläuferzellen entstehen. Insgesamt haben wir eine leistungsfähige Methode für die zufällige Aktivierung der Transgenexpression in einer zelltypspezifischen Weise für Zebrafische entwickelt, die auf einer, in einem einzigen Vektor enthaltenen, induzierbaren, und abstimmbaren Multi-Cistron-Expressionseinheit basiert.
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