Biosynthesis of phlorbenzophenone-derived meroterpenes in Hypericum sampsonii
The medicinal value of plants of the Hypericaceae and Clusiaceae families is linked to a variety of bioactive meroterpenes, which arise from the conjunction of terpene and polyketide biosyntheses. Their assembly can be divided into two phases: the formation of the basic polyketide core and the subsequent isoprenyl functionalization and cyclization. In the medicinal plant Hypericum sampsonii, most meroterpenes belong to the classes of polyprenylated xanthones and polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols (PPAPs), which are both derived from phlorbenzophenone. While the biosynthesis of the polyketide core is well described, little is known about the prenylation pathway leading to the complex PPAP scaffolds. The aim of this study was the identification and functional characterization of the aromatic prenyltransferases responsible for the polyprenylation of phlorbenzophenone and xanthone metabolites in H. sampsonii. Transcriptomic mining followed by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and functional characterization led to the discovery of seven enzymes involved in meroterpene biosynthesis. These include a pair of bifunctional enzymes that catalyze prenylative cyclization reactions to yield the bicyclic PPAP regiomers, 7-epi-nemorosone (type A) and 7-epi-clusianone (type B). Their detailed biochemical and mechanistic characterization by in vitro, in vivo, and in silico approaches revealed amino acid residues that stabilize inverted substrate binding modes in the two active site cavities. Reciprocal mutagenesis results in the conversion of the type A-forming enzyme into a type B cyclase by ninefold mutation. The present study contributes to the elucidation of the unique biochemistry that yields type A and B bicyclo[3.3.1]nonane cores in plants and provides key building blocks for biotechnological efforts to sustainably produce complex meroterpenes for preclinical development.
Der medizinische Nutzen von Pflanzen der Familien Hypericaceae und Clusiaceae ist mit einer Vielzahl bioaktiver Meroterpene zu erklären, die aus der Verbindung von Terpen- und Polyketid-Biosynthese hervorgehen. Ihre Biosynthese lässt sich in zwei Phasen unterteilen: die Bildung des Polyketid-Grundgerüsts und die anschließende Isoprenylfunktionalisierung und Zyklisierung. In der Arzneipflanze Hypericum sampsonii gehören die meisten Meroterpene zu den Klassen der polyprenylierten Xanthone und der polyzyklischen polyprenylierten Acylphloroglucinole (PPAPs), welche sich beide von Phlorbenzophenon ableiten. Während die Biosynthese des primären Polyketids gut beschrieben ist, ist über den Prenylierungsweg, der zu den komplexeren PPAP-Gerüsten führt, nur wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung der aromatischen Prenyltransferasen, die für die Polyprenylierung von Phlorobenzophenon- und Xanthonmetaboliten in H. sampsonii verantwortlich sind. Transkriptomische Analysen, gefolgt von heterologer Expression in Saccharomyces cerevisiae und anschließender funktioneller Charakterisierung führten zur Entdeckung von sieben enzymen, die an der Meroterpen-Biosynthese beteiligt sind. Darunter ist ein Paar bifunktioneller Enzyme, die prenylative Zyklisierungsreaktionen katalysieren, aus denen die bizyklischen PPAP-Regiomere 7-epi-Nemoroson (Typ-A) und 7-epi-Clusianon (Typ-B) hervorgehen. Ihre detaillierte biochemische und mechanistische Charakterisierung durch in vitro-, in vivo und in silico-Ansätze deckte Aminosäurereste auf, welche unterschiedliche Modi für die Substratbindung im aktiven Zentrum der Bindetasche stabilisieren. Die reziproke Mutagenese von neun Aminosäureresten resultierte in der Umwandlung des Typ-A-bildenden Enzyms in eine Typ-B Zyklase. Die vorliegende Studie trägt zur Aufklärung der einzigartigen Biochemie bei, die zur Bildung von Bicyclo[3.3.1]nonan-Gerüsten des Typs A und B in Pflanzen beiträgt, und wichtige Bausteine für biotechnologische Ansätze zur nachhaltigen Herstellung komplexer Meroterpene liefert.
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