Crystallization of type III polyketide synthases from Hypericaceae and Gentianaceae, immunodetection of CYP736A163 involved in aucuparin biosynthesis in Rosaceae, and functional characterisation of prenyltransferases involved in hyperforin biosynthesis in Hypericaceae
Plants produce a variety of complex chemical molecules that originate from secondary metabolism, helping them adapt to their environment and ensuring their survival, though the precise mechanism of action of individual components is often unknown. Due to their taste and nutritional value and their biological activity, plants or plant preparations are used by humans either as food, as is the case with members of the Rosaceae family (apples, pears, stone fruits, etc.), or as medicine, such as preparations from Hypericum perforatum. Enzymes are crucial for the biosynthesis of these secondary metabolites. Therefore, this work investigates various enzymes involved in the formation of secondary compounds in plants. One objective is the immunolocalization of CYP736A, an ER- anchored membrane protein involved in phytoalexin biosynthesis in Rosaceae species, such as Sorbus aucuparia cell suspension cultures. Phytoalexins are chemical compounds whose synthesis is prompted by an external stimulus, such as contact with a pathogen. This investigation aims to explore the possible relocation of CYP736A after pathogenic attack and its potential involvement in a metabolon implicated in phytoalexin biosynthesis. A specially produced peptide antibody, targeting a defined, surface exposed region of the protein, was used for precise identification of CYP736A. It was able to specifically detect the recombinant protein but failed to detect the protein extracted from plant material in Western blots. Moreover, the cell suspension cultures have to be reconsidered for these experiments, prompting the discussion of alternative approaches. Additionally, three type III polyketide synthases were examined regarding their three-dimensional structure using X-ray crystallography. These enzymes play an important role in the biosynthesis of secondary metabolites, providing the backbone for further reactions to more complex molecules. The two type III PKS from Gentianaceae, CeBPS and ScBPS, can process large substrates, suggesting a novel catalytic mechanism. The type III PKS from Hypericum polyphyllum is a novel bifunctional PKS, whose structural elucidation should contribute to the understanding of the cyclization mechanisms. However, in this work, it was not possible to crystallize CeBPS and ScBPS. Furthermore, the crystals of HpBFPKS were unsuitable for elucidating the protein structure. Finally, during this work, a prenyltransferase, PT24 from Hypericum perforatum was characterized, and its kinetic parameters were determined. It was found that the protein, depending on the substrate, is involved in one of the initial steps of the biosynthesis of hyperforin and adhyperforin as well as secohyperforin and adsecohyperforin. The identification and characterization of this enzyme contribute to understanding the biosynthetic pathway of these PPAPs. This may enable the synthesis of analogues with fewer side effects, thereby enhancing therapeutic benefits
Pflanzen produzieren eine Vielzahl komplexer chemischer Moleküle, die dem Sekundärstoffwechsel entspringen und der Pflanze zur Anpassung an die Umwelt sowie zur Sicherung ihres Überlebens dienen. Der genaue Wirkmechanismus der einzelnen Komponenten ist jedoch oft nicht bekannt. Aufgrund ihres Geschmacks und Nährwerts bzw. ihrer biologischen Aktivität werden Pflanzen oder Zubereitungen aus Pflanzen vom Menschen als Nahrungsmittel, wie zum Beispiel Angehörige der Rosacee (Äpfel, Birnen, Steinobst etc.), oder Arzneimittel, wie zum Beispiel Zubereitungen aus Hypericum perforatum, genutzt. Für die Biosynthese dieser Sekundärmetaboliten sind Enzyme von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit werden daher verschiedene Enzyme untersucht, die an der Bildung von Sekundärstoffen in Pflanzen beteiligt sind. Ein Ziel ist die Immunlokalisierung des CYP736A in Sorbus aucuparia-Suspensionskulturen, eines Membranproteins, das an der Phytoalexin-Biosynthese in Rosaceae-Arten beteiligt ist. Phytoalexine sind chemische Verbindungen deren Synthese durch einen externen Stimulus ausgelöst wird, beispielsweise durch den Kontakt mit einem Krankheitserreger. Diese Untersuchung zielt darauf ab, die mögliche Relokalisierung nach pathogenem Befall und die potenzielle Beteiligung an einem Metabolon für die Biosynthese von Phytoalexinen zu erforschen. Ein speziell hergestellter Peptid-Antikörper, der auf einen definierten, oberflächenexponierten Bereich des Proteins zielt, wurde zur präzisen Identifizierung von CYP736A verwendet. Er konnte das rekombinant hergestellte Protein spezifisch detektieren, scheiterte jedoch bei der Detektion des aus Pflanzenmaterial extrahierten Proteins im Western-Blot. Zudem sind die Suspensionskulturen für diese Experimente zu überdenken, weshalb alternative Durchführungsweisen diskutiert werden. Des Weiteren sollten drei Typ-III-Polyketidsynthasen hinsichtlich ihrer dreidimensionalen Struktur mittels Röntgenstrukturanalyse untersucht werden. Diese Enzyme spielen eine wichtige Rolle bei der Biosynthese von Sekundärmetaboliten, da sie das Grundgerüst für weitere Reaktionen zu komplexeren Molekülen bilden. Die beiden Typ-III-PKS aus Gentianaceae, CeBPS und ScBPS, sind in der Lage, große Substrate umzusetzen, weshalb ein neuartiger katalytischer Mechanismus vermutet wird. Die Typ-III-PKS aus Hypericum polyphyllum ist eine neuartige bifunktionale PKS, deren Strukturaufklärung zur Erläuterung der Zyklisierungsmechanismen beitragen sollte. In dieser Arbeit gelang es jedoch nicht, CeBPS und ScBPS zu kristallisieren. Zudem waren die Kristalle der HpBFPKS nicht geeignet, um die Struktur des Proteins aufzuklären. Abschließend wurde in dieser Arbeit eine Prenyltransferase, die PT24 aus Hypericum perforatum, charakterisiert und ihre kinetischen Parameter bestimmt. Es stellte sich heraus, dass das Protein, je nach Substrat, an einem der ersten Schritte der Biosynthese von Hyperforin und Adhyperforin bzw. Secohyperforin und Adsecohyperforin beteiligt ist. Die Identifizierung und Charakterisierung dieses Enzyms trägt zum Verständnis des Biosyntheseweges von Hyperforin bei und könnte Wege für eine biotechnologische oder semi-synthetische Produktion eröffnen.
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