Untersuchungen zu möglichen Interaktionspartnern der DNA Methyltransferase AamA von Acinetobacter baumannii und zum Einfluss von Meropenem auf das AamA-abhängige Methylom und Transkriptom
Acinetobacter baumannii hat sich aufgrund seiner Virulenz- und Persistenzfaktoren sowie des Erwerbs von Antibiotikaresistenzen in den letzten Jahrzehnten zu einem herausfordernden Keim entwickelt. Die Aufnahme von DNA kann dabei während der Bewegung entlang feuchter Oberflächen erfolgen. Bei Arbeiten zur Motilität von A. baumannii war eine Mutante mitdefektem aamA Gen identifiziert worden, welches für eine DNA (Adenin N6) Methyltransferase (MTase) kodiert. Die aamA- Mutante zeigte im Vergleich zum Wildtyp-Stamm verringerte Motilität, attenuierte Virulenz und gesteigerte Sensitivität gegenüber Tetracyclin. Aufgrund einer ausgeprägten differenziellen Methylierung des Genoms durch AamA, wie es zuvor noch für keine andere solitäre MTase beschrieben wurde und der geringen Aktivität in vitro wurde die Hypothese aufgestellt, dass die differentielle DNA-Methylierung durch Interaktionspartner von AamA ermöglicht wird. Durch Kombination von Pull-down Experimenten und Massenspektrometrie wurde die bifunktionelle Aconitat-Hydratase 2 (AcnB) als möglicher Wechselwirkungspartner identifiziert. Aufgrund der räumlichen Nähe zu aamA wurden zusätzlich noch die Gene nrdR (kodiert ein transkriptionelles Regulatorprotein)
und ribD (kodiert eine Pyrimidin-Deaminase/Reduktase) in Betracht gezogen. Alle Gene
wurden kloniert und die Proteine rekombinant hergestellt und gereinigt. Strukturanalysen der Proteine erfolgten durch Röntgenkleinwinkelstreuexperimente (SAXS). Nativgelelektrophorese mit und ohne DNA, chemische Quervernetzung und SAXS lieferten für alle drei untersuchten Proteine Hinweise auf eine Interaktion mit AamA. Zusätzlich wurde zur Charakterisierung des AamA Regulons eine Genom- sowie Transkriptomanalyse des Stamms 29D2 und der korrespondierenden aamA- Mutante bei unterschiedlichen Wachstumsbedingungen unter Zugabe von Meropenem durchgeführt. Dabei konnte neben einer sehr guten Reproduzierbarkeit auch die differenzielle Methylierung von AamA bestätigt werden. Sowohl die untersuchten Umweltbedingungen (planktonisch bzw. Motilitätsbedingungen) als auch der Zusatz von Meropenem zeigten einen wesentlichen Einfluss auf die AamA-spezifischen Methylierungsraten. Bei den Transkriptionsergebnissen zeigte die aamA- Mutante im Vergleich zum Wildtyp unter planktonischen Bedingungen und Meropenem-Stress ein ausgeprägtes differentielles Transkriptionsmuster. Mit dieser Arbeit konnte verdeutlicht werden, wie einzigartig die AamA-spezifische Methylierung im Vergleich zu anderen solitären MTasen ist.
Acinetobacter baumannii has developed into a challenging pathogen in recent decades due to its virulence and persistence factors as well as acquisition of antibiotic resistences. DNA uptake can occur while moving along wet surfaces. While working on the motility of
A. baumannii a mutant showing a malfunction in the aamA gene, which encodes for a DNA (adenine N6) methyltransferase (MTase), was identified. In comparison to the wildtype this aamA- mutant exhibited reduced motility, attenuated virulence and a higher sensitivity to tetracycline. Based on a pronounced AamA-dependent differential methylation of the genome unprecedented for solitary MTases and the low enzymatic activity in vitro, the hypothesis of possible interaction partners of AamA facilitating the differential methylation was put forward. Through combination of pull-down experiments and mass spectrometry the bifunctionell aconitate-hydratase 2 (AcnB) was identified as possible interaction partner. Due to the aamA proximity, genes nrdR (encoding a transcriptional regulatory protein) and ribD (encoding a pyrimidine-deaminase/reductase) were also taken into consideration. All genes were cloned and proteins were recombinantly produced and purified. Structure analyzes of proteins were conducted using small-angle X-ray scattering (SAXS). Native gel electrophoresis with and without DNA, chemical cross-linking and SAXS provided clues of an interaction with AamA for all analysed proteins. For further characterization of the AamA regulon, a genome and transcriptome analysis of strain 29D2 and the associated aamA- mutant comparing different growth conditions and meropenem supplementation was performed. In addition to a very good reproducibility, the differential methylation could also be confirmed. Both, the growth conditions examined (planktonic and motility conditions) and the addition of meropenem had a significant influence on AamA-dependent methylation rates. Transcriptomic analyses revealed a distinct differential gene expression pattern of the aamA mutant compared to the wildtype under planktonic conditions in the presence of meropenem stress. This work clarifies the uniqueness of the AamA-specific methylation in comparison to other known solitary MTases.
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