Arabidopsis thaliana is a glucosinolate containing plant, using the glucosinolate-myrosinase system as a chemical defense against insects and microbial pathogens, mainly by the effects of glucosinolate-derived isothiocyanates. Nitrile-specifier proteins (NSPs) act upon breakdown of glucosinolates and lead to the formation of simple nitriles at the expense of isothiocyanates and derived products. Roots of A. thaliana Col-0 express three NSPs: NSP1/-3/-4. The fate of indole glucosinolates, which are predominant in roots, upon breakdown is less well understood as methods for the detection and quantitation of breakdown products such as nitriles and carbinols are lacking. Moreover, the biological relevance of NSP abundance in roots is unknown. Effects of a lacking ability to form nitriles on soil microbes is conceivable.
The following results were obtained and highlight the importance of especially aliphatic glucosinolate biosynthesis, but also of the ability to generate nitriles upon glucosinolate breakdown for the assembly of the bacterial/archaeal communities in the rhizosphere of A. thaliana:
- Derivatisation conditions were established which allow for a GC-MS based quantitation method for indolic carbinols and nitriles in plant homogenates. The quantitation method was successfully applied to homogenates of multiple A. thaliana lines, demonstrating an impact of NSPs on glucosinolate breakdown product profiles. NSP1 was identified as the main contributor to nitrile formation from indole glucosinolates while NSP3 did not contribute.
- The newly generated line nsp134 with non-functional alleles of NSP1, NSP3 and NSP4 was cha-racterised phytochemically. This demonstrated a lack of nitrile formation in homogenates of roots and rosettes.
- Mutant lines with defects in glucosinolate biosynthesis (cyp79b2/b3, myb28/29, qKO) or nitrile formation (nsp1-1, nsp3-2, nsp134) were grown for isolation of total community-DNA from the rhizosphere in comparison to Col-0. The bact./arch. community composition of the rhizosphere was analysed by DGGE and 16S rRNA gene amplicon sequencing.
- DGGE community fingerprinting targeting the bact./ arch. microbiota identified differences between all genotypes and Col-0, and a rhizosphere effect.
- Reduced alpha-diversity indices were observed in the bact./ arch. community of the myb28/29 mutant in comparison to Col-0. Effects on the beta-diversity were demonstrated for the rhizosphere community of all genotypes in comparison to Col-0.
- Alterations of the core microbiota were identified on the genus rather than the phylum level, with an influence on several taxa throughout all tested genotypes. The myb28/29, followed by the qKO genotype showed the strongest overall effects regarding beta-diversity and community composition, but NSP mutants also showed significant effects.
- For some genera, the effects of NSP deficiency were strikingly distinct from those of impaired glucosinolate biosynthesis, as expressed by opposing relative. This emphasised the differential reactions of microbial taxa in the rhizosphere to the absence or presence of aliphatic and indole glucosinolate-derived breakdown products.
Als Glucosinolat-enthaltende Pflanze verwendet Arabidopsis thaliana das Glucosinolat-Myrosinase-System zur chemischen Verteidigung gegen Insekten und mikrobielle Pathogene, v.a. wegen der Effekte der Glucosinolat-abgeleiteten Isothiocyanate. Nitril-spezifizierende Proteine (NSPs) wirken auf den Abbau von Glucosinolaten ein und führen zur Bildung von Nitrilen auf Kosten von Isothiocyanaten und abgeleiteten Produkten. Wurzeln von A. thaliana Col-0 exprimieren drei NSPs: NSP1, NSP3 und NSP4. Das Schicksal der vorherrschend in den Wurzeln vorkommenden Indol-Glucosinolate beim Abbau ist weniger gut aufgeklärt, da Detektions- und Quantifizierungsmethoden für Carbinole und Nitrile fehlen. Außerdem ist die biologische Relevanz des NSP-Vorkommens in Wurzeln unbekannt. Effekte einer fehlenden Fähigkeit zur Nitril-Bildung auf Boden-Mikroorganismen sind denkbar.
Folgende Ergebnisse wurden erzielt, die die Bedeutung von v.a. der Biosynthese aliphatischer Glucosinolate, aber auch von der Fähigkeit, Nitrile während des Glucosinolat-Abbaus herzustellen, für die Zusammenstellung der Bakterien-/Archaeen-Gemeinschaft in der Rhizosphäre von A. thaliana herausstellen:
- GC-MS-geeignete Derivatisierungsbedingungen für die Quantifizierung von indolischen Carbinolen und Nitrilen in Pflanzenhomogenaten wurden etabliert. Die Methode wurde erfolgreich auf Homogenate verschiedener A. thaliana-Linien angewandt. Hierbei konnte ein Einfluss von NSPs auf die Profile von Glucosinolat-Abbauprodukten gezeigt werden. NSP1 wurde als Haupt-Beiträger zur Nitrilbildung aus Indol-Glucosinolaten in Homogenaten identifiziert, während NSP3 nicht beitrug.
- Die neu hergestellte Linie nsp134 mit nicht-funktionellen Allelen von NSP1/-3/-4, wurde phytochemisch charakterisiert. Hierbei wurde ein Fehlen der Nitrilbildung aus Glucosinolaten in Wurzel- und Rosettenhomogenaten gezeigt.
- Neben Col-0 wurden verschiedene Mutanten mit entsprechenden Defekten in der Glucosinolat-Biosynthese (cyp79b2/b3, myb28/29, qKO) oder Nitrilbildung (nsp1-1, nsp3-2, nsp134) angezogen. Die total community-DNA wurde isoliert und per DGGE und 16S rRNA gene amplicon sequencing wurden Analysen der Bakt.-/Arch.-Gemeinschaft in der Rhizosphäre durchgeführt.
- DGGE-Fingerprinting der Bakt.-/Arch.-Gemeinschaft identifizierte Unterschiede zwischen allen Genotypen und Col-0, sowie einen Rhizosphären-Effekt.
- Reduzierte Alpha-Diversitäts-Indizes im Vergleich zu Col-0 wurden für die Bakt.-/Arch.-Gemeinschaft der myb28/29-Mutante beobachtet. Effekte auf die Beta-Diversität waren für alle Genotypen im Vergleich zu Col-0 nachweisbar.
- Veränderungen des Kernmikrobioms wurden stärker auf Genus- als auf Phylum-Ebene identifiziert. Der myb28/29-Genotyp, gefolgt qKO, hatte den stärksten Einfluss auf die Beta-Diversität und die Zusammensetzung der Rhizosphären-Gemeinschaft, aber auch für die NSP-Mutanten wurden signifikante Effekte beobachtet.
- Effekte auf ausgewählte Genera zeigten deutliche Unterschiede in Bezug auf NSP-Mangel verglichen mit beeinträchtigter Glucosinolat-Biosynthese, ausgedrückt durch gegenläufige relative Abundanzen der Taxa. Dies betonte die differentiellen Reaktionen der mikrobiellen Taxa auf die Ab- bzw. Anwesenheit von Abbauprodukten von aliphatischen und Indol-Glucosinolaten.
