Characterization of the immunomodulatory protein M35 of murine cytomegalovirus
Herpesviruses are renowned for their ability to stay in the host organism lifelong in a latent state, intermitted with episodes of reactivation. This form of infection is possible due to the high degree of adaptation that developed during the long co-evolution of host and virus. While active replication usually elicits only mild symptoms in an otherwise healthy patient, infection with herpesviruses such as human cytomegalovirus (HCMV) can cause life-threatening symptoms up to end-organ failure when the immune system is impaired due to genetic conditions, sickness or deliberate suppression in the transplant setting. Moreover, HCMV particles can cross the placental barrier in a pregnant woman and establish infection in the foetus. This can lead to various dysfunctions, malformations or even the death of the unborn child and represents the worldwide leading viral cause of congenital birth defects. Treatment options are limited and no vaccine is currently available to prevent HCMV infections. As herpesviruses display a highly restricted host range, HCMV infection cannot be studied in vivo. To provide a better understanding of the interplay of cytomegaloviruses and the host immune system, this study focused on murine cytomegalovirus (MCMV) as the well-established in vivo model of HCMV research. MCMV encodes the protein M35 which is incorporated into the virion and released into the host cell immediately after viral entry. Our group has previously identified M35 as inhibitor of the type I interferon (IFN) response, one of the first defence mechanisms encountered by viruses during primary infection. Type I IFNs are induced upon detection of foreign or aberrantly localised structures such as double-stranded DNA in the cytosol by pattern recognition receptors (PRRs). PRR stimulation induces an intracellular signalling cascade that leads to the activation of the host transcription factors interferon regulatory factor 3 (IRF3) and nuclear factor κ-light chain enhancer of activated B-cells (NF-κB). Together, these factors govern expression of the gene encoding IFNβ (Ifnb1), the first messenger that is produced and secreted by non-immune cells to alarm the surrounding tissue and activate the further immune response. M35 deftly impairs expression of the type I IFN genes, but the precise mechanism of its immunomodulatory activity remained to be shown. This knowledge improves our understanding of the finely orchestrated series of events that form the host’s type I IFN response as well as of viral interference and could reveal novel possibilities for therapeutic interventions. In this study, the structural and mechanistical details of M35’s immunomodulatory activity were characterised. The recently determined three-dimensional structure of M35 revealed that the purified protein forms homodimers and co-immunoprecipitation of differently tagged M35 variants verified M35 dimerisation in cell lysates. As the fold of M35 was similar to that of its predicted homologue in human herpesvirus (HHV) 6B, U14, the U14 proteins of HHV6A, HHV6B, and HHV7 were assayed for their potential to inhibit PRR signalling-induced Ifnb1 expression in a luciferase-based reporter assay. Only U14 of HHV7 displayed a minor ability to impair Ifnb1 promoter induction, suggesting that the shared overall fold of these proteins does not conserve the immunomodulatory function determined for M35. Moreover, the crystal structure was used as a basis to investigate the contribution of prominent structural features to M35’s function as modulator of the type I IFN response. Reverse genetic analysis identified three loss-of-function mutants and their further characterisation suggested that dimerisation is critical for M35’s immunomodulatory activity. Application of purified M35 protein to an electrophoretic mobility shift assay (EMSA) demonstrated sequence-specific binding of M35 to a probe carrying the sequence of the IFNβ enhancer, the regulatory element governing Ifnb1 transcription, in vitro. Alteration of the probe sequence further indicated that the motif recognised by M35 overlapped with that of IRF3. This suggested a competition between M35 and IRF3 for binding to the Ifnb1 promoter. Indeed, examination of IRF3’s recruitment to the Ifnb1 promoter after PRR stimulation by chromatin immunoprecipitation (ChIP) showed that promoter binding of IRF3 was reduced in M35-expressing cells. Aiming to validate a direct interaction of M35 with chromatin in the host cell, ChIP experiments that targeted M35-bound genome fragments in M35-expressing or MCMV-infected cells were performed. Although no enrichment of the promoter of Ifnb1 or other IRF3 target genes was detected after M35-specific precipitation, a sequence-unspecific, M35-specific DNA interaction with the viral genome was discovered. This unexpected observation implied additional DNA-binding functions of M35 in the viral replication cycle. As an alternative approach to determine M35’s effect on expression of IRF3-dependent and other genes, transcriptomic and proteomic analyses were applied to M35-expressing cells. First, thiol (SH)-linked alkylation for the metabolic sequencing of RNA (SLAM-seq) was used to define IRF3-dependent and IFN-stimulated genes (ISGs) in murine cells. Then, differential gene expression was analysed for the effect of M35 on gene regulation in stimulated and untreated cells. Already prior to stimulation, a subgroup of ISGs that is also regulated by IRF3 was specifically downregulated in stably M35-expressing cells. Quantification of selected transcripts after MCMV infection confirmed that M35 directly antagonises induction of several IRF3-dependent ISGs. In addition, a considerable set of genes whose regulation was independent of the type I IFN response was differentially expressed in the presence of M35. This added to the suspicion that M35’s role during viral replication may reach beyond the modulation of the immediate type I IFN response. In summary, the work presented herein describes M35 as a homodimeric DNA-binding protein that inhibits induction of Ifnb1, and possibly of further IRF3-dependent genes, by directly binding to their promoters and antagonising recruitment of IRF3. The results show that M35 interferes with expression of different groups of genes in the innate immune response, indicating a considerably broader influence of M35 on the antiviral response than recognised before.
Herpesviren sind wohlbekannt für ihre Fähigkeit, lebenslang in einem latenten Zustand im Wirtsorganismus zu verbleiben, unterbrochen von Episoden der Reaktivierung. Diese Form der Infektion ist durch das hohe Maß an Anpassung möglich, das sich während der langen Koevolution von Wirt und Virus entwickelt hat. Während die aktive Replikation bei einem ansonsten gesunden Patienten in der Regel nur leichte Symptome hervorruft, kann eine Infektion mit Herpesviren wie dem humanen Cytomegalievirus (HCMV) lebensbedrohliche Symptome bis hin zu Organversagen verursachen, wenn das Immunsystem aufgrund genetischer Veranlagungen, Krankheit oder beabsichtigter Unterdrückung im Rahmen einer Transplantation beeinträchtigt ist. Darüber hinaus können HCMV-Partikel bei Schwangeren die Plazentaschranke überwinden und eine Infektion des Fötus verursachen. Dies kann zu verschiedenen Funktionsstörungen, Missbildungen oder sogar zum Tod des ungeborenen Kindes führen und stellt die weltweit führende virale Ursache für angeborene Fehlbildungen dar. Die Behandungsmöglichkeiten sind begrenzt und es gibt derzeit keinen Impfstoff zur Verhinderung von HCMV-Infektionen. Da Herpesviren ein stark eingeschränktes Wirtsspektrum aufweisen, kann die HCMV-Infektion nicht in vivo untersucht werden. Um das Zusammenspiel von Cytomegaloviren und dem Immunsystem des Wirts besser zu verstehen, konzentrierte sich diese Studie auf das murine Cytomegalovirus (MCMV) als etabliertes In-vivo-Modell der HCMV-Forschung. MCMV kodiert das Protein M35, das Teil des Viruspartikels ist und unmittelbar nach dem Eindringen des Virus in der Wirtszelle freigesetzt wird. Unsere Gruppe hat M35 zuvor als Inhibitor der Typ-I-Interferon (IFN)-Antwort identifiziert, einem der ersten Abwehrmechanismen, auf den Viren während der Primärinfektion treffen. IFNs vom Typ I werden durch die Erkennung fremder oder fehlerhaft lokalisierter Strukturen, zum Beispiel doppelsträngiger DNA im Zytosol, von Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors, PRRs) ausgelöst. Die PRR-Aktivierung induziert eine intrazelluläre Signalkaskade, die zur Aktivierung der Wirtstranskriptionsfaktoren interferon regulatory factor 3 (IRF3) und nuclear factor κ-light chain enhancer of activated B-cells (NF-κB) führt. Zusammen steuern diese Faktoren die Expression des Gens Ifnb1, das für IFNβ kodiert, den ersten Botenstoff, der von Nicht-Immunzellen produziert und ausgeschüttet wird, um das umliegende Gewebe zu alarmieren und die weitere Immunantwort zu aktivieren. M35 beeinträchtigt die Expression von Typ-I-IFN-Genen, aber der genaue Mechanismus seiner immunmodulatorischen Aktivität musste noch gezeigt werden. Dieses Wissen trägt zu unserem Verständnis der genau orchestrierten Abfolge von Ereignissen bei, die die Typ-I-IFN-Antwort und deren virale Eingriffe ausmachen, und kann neue Möglichkeiten für therapeutische Eingriffe eröffnen. In dieser Studie wurden die strukturellen und mechanistischen Details der immunmodulatorischen Aktivität von M35 charakterisiert. Die kürzlich ermittelte dreidimensionale Struktur von M35 zeigte, dass das gereinigte Protein Homodimere bildete, und die Koimmunpräzipitation von unterschiedlich markierten M35-Variianten bestätigte die Dimerisierung von M35 in Zelllysaten. Da die Faltung von M35 ähnlich der seines vorhergesagten Homologs im humanen Herpesvirus (HHV) 6B, U14, war, wurden die U14-Proteine von HHV6A, HHV6B und HHV7 auf ihr Potenzial zur Hemmung der durch den PRR-Signalweg induzierten Ifnb1-Expression in einem Luziferase-basierten Reporterassay untersucht. Nur U14 von HHV7 zeigte ein geringes Vermögen, die Ifnb1-Promoterinduktion zu beeinträchtigen, was darauf hindeutete, dass die überwiegend ähnliche Faltung die für M35 ermittelte immunmodulatorische Funktion nicht erhält. Darüber hinaus wurde die Kristallstruktur als Grundlage für die Untersuchung des Beitrags hervorstechender Strukturmerkmale zur Funktion von M35 als Modulator der Typ-I-IFN-Antwort verwendet. Durch eine reverse genetische Analyse wurden drei Mutanten mit Funktionsverlust identifiziert, deren weitere Charakterisierung darauf schließen ließ, dass die Dimerisierung für die immunmodulatorische Aktivität von M35 entscheidend ist. Die Anwendung des gereinigten M35-Proteins in einem electrophoretic mobility shift assay (EMSA) zeigte die sequenzspezifische Bindung von M35 an eine Sonde mit der Sequenz des IFNβ-Verstärkers, des regulatorischen Steuerungselements der Ifnb1-Transkription. Die Abwandlung der Sondensequenz zeigte außerdem, dass sich das von M35 erkannte Motiv mit dem von IRF3 überschnitt. Dies deutet auf eine Konkurrenz zwischen M35 und IRF3 um die Bindung an den Ifnb1-Promotor hin. Tatsächlich zeigte die Untersuchung der IRF3-Rekrutierung an den Ifnb1-Promotor nach PRR-Stimulation durch Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), dass die Promotorbindung von IRF3 in M35-exprimierenden Zellen reduziert war. Um eine direkte Interaktion von M35 mit dem Chromatin der Wirtszelle zu bestätigen, wurden ChIP-Experimente zur Analyse der M35-gebundenen Genomfragmente in M35-exprimierenden oder MCMV-infizierten Zellen durchgeführt. Obwohl nach der M35-spezifischen Ausfällung keine Anreicherung des Promotors von Ifnb1 oder anderer IRF3-Zielgene festgestellt wurde, wurde eine sequenzunspezifische, M35-spezifische Interaktion mit dem viralen Genom entdeckt. Diese unerwartete Beobachtung deutet auf zusätzliche DNA-bindende Funktionen von M35 im viralen Lebenszyklus hin. Als alternativer Ansatz zur Bestimmung der Wirkung von M35 auf die Expression IRF3-abhängiger und weiterer Gene wurden Transkriptom- und Proteomanalysen an M35-exprimierenden Zellen durchgeführt. Zunächst wurde thiol-(SH-)linked alkylation for the metabolic sequencing of RNA (SLAM-seq) verwendet, um IRF3-abhängige und IFN-stimulierte Gene (ISGs) in Mauszellen zu definieren. Anschließend wurden die Unterschiede der Genexpression auf die Wirkung von M35 in stimulierten und unbehandelten Zellen untersucht. Bereits vor der Stimulation wurde eine Untergruppe der ISGs, die auch durch IRF3 reguliert wird, in stabil M35-exprimierenden Zellen spezifisch niedriger exprimiert. Die Quantifizierung ausgewählter Transkripte nach einer MCMV-Infektion bestätigte, dass M35 der Expression mehrerer IRF3-abhängiger ISGs direkt entgegenwirkt. Darüber hinaus wurde eine beträchtliche Anzahl von Genen, deren Regulierung unabhängig von der Typ-I-IFN-Antwort war, in Gegenwart von M35 anders exprimiert. Das bestärkte die Vermutung, dass die Rolle von M35 während der viralen Replikation über die Modulation der unmittelbaren Typ-I-IFN-Antwort hinausgehen könnte. Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Arbeit M35 als homodimeres, DNA-bindendes Protein, das die Induktion von Ifnb1 und möglicherweise weiterer IRF3-abhängiger Gene hemmt, indem es direkt an ihre Promotoren bindet und die Rekrutierung von IRF3 verhindert. Die Ergebnisse zeigen, dass M35 die Expression verschiedener Gengruppen in der angeborenen Immunreaktion beeinträchtigt, was auf einen wesentlich breiteren Einfluss von M35 auf die antivirale Antwort hindeutet als bisher bekannt.
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