Development of a new production strategy for recombinant HBsAg virus-like particles suitable for serological screening and structural investigations
Hepatitis B virus (HBV) is a serious threat to global human health as it is the causative agent for one of the most frequent chronic viral infections. Development of chronic infection often leads to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Therefore, research groups all over the world try to find novel vaccines, diagnostic methods and therapies for hepatitis B. One focus of these endeavors is the hepatitis B surface antigen (HBsAg) which occurs in three versions: small (S), middle (M) and large (L). HBsAg itself and the anti-HBs antibodies after seroconversion are important serological markers for the progression of infection. HBsAg can form non-infectious virus-like particles (VLP), which can be produced and assembled using recombinant protein production systems. Most recombinantly produced HBsAg is S-HBsAg from yeast systems. This is the case because yeast protein production is cost-effective and scalable. Additionally, the S version is the minimum prerequisite for particle formation and display of the major antigenic epitope. In serological assays, it is not well defined what version of HBsAg is used for detection of anti-HBs antibodies and in which host they were produced. When attempting to establish a defined multiplex serological assay it was found that commercial recombinant HBsAg samples did not allow an efficient discrimination between anti-HBs reactive and non-reactive serum samples. Thus, reproducible produced recombinant HBsAg VLPs would be a powerful reference in serological assays. Yeast recombinant protein production systems are in principle able to perform simple posttranslational modifications (PTM); however, they do not glycosylate the S-HBsAg. Therefore, higher eukaryotic systems, like insect or mammalian cell culture, are needed to generate native-like glycosylated S-HBsAg. In this thesis, we established a fast and easy-to-perform reproducible production and maturation strategy for HBsAg VLPs. S-HBsAg was extracted from HEK293 suspension cell line following transient gene expression. The VLPs were not formed during protein production. Subsequent to purification, the S-HBsAg was treated to assemble the VLPs in vitro, followed by epitope maturation. Resulting material was biochemically, biophysically and biologically characterized and stability of these properties were assessed and compared to commercial HBsAg samples. The antigenic quality of our S-HBsAg VLPs in a multiplex serological assay was found to be most suitable for discrimination between anti-HBs reactive and negative sera. Moreover, a simple serological ELISA, without the need for specialized equipment like Luminex systems, for the same purpose was set up and validated. Furthermore, the HBsAg in the VLP is highly interesting from a structure biological perspective. It has been investigated for around 40 years; still, only very recently the first subnanometer structure was solved at 6.3 Å resolution by cryogenic electron microscopy (cryoEM). The particles used to unravel this structure were isolated from infected serum. However, the internal and external loops are not structurally resolved; the external loop is of great interest because it is harboring the antigenic epitope. HBsAg VLPs, especially recombinant ones, are agreed upon to be heterogeneous in nature. Nevertheless, recombinant HBsAg VLPs could be advantageous for elucidation of the epitope because they are produced and assembled in a controlled environment, incorporating only the S-HBsAg. In contrast, native VLPs consist of a mixture of S- and M-HBsAg with traces of L-HBsAg. Thus, recombinant VLPs should possess a more uniform particle surface. Therefore, we devised an approach to improve HBsAg VLP samples for structural investigation by cryoEM. Based on the established production and maturation protocol and by judging the assembly based on particle size and mass, we identified native-like assembled recombinant HBsAg VLPs.
Das Hepatitis B Virus (HBV) stellt eine große Bedrohung für den Menschen dar, da es eine der häufigsten chronischen Virusinfektionen verursacht. Die Entwicklung der chronischen Infektion kann zu Leberzirrhose und hepatozellulären Karzinomen führen. Viele Forschungsgruppen auf der ganzen Welt versuchen daher, neue Impfstoffe, Diagnosemethoden und ein Heilmittel für Hepatitis B zu finden. Ein wichtiger Akteur bei diesen Fortschritten ist das Hepatitis B Oberflächenantigen (HBsAg), das in drei Versionen existiert: klein (S), mittel (M) und groß (L). HBsAg selbst und die anti-HBs Antikörper nach Serokonversion sind wichtige serologische Marker für den Fortschritt der Infektion. HBsAg kann nicht-infektiöse virusähnliche Partikel (VLP) bilden, die mit rekombinanten Produktionssystemen hergestellt und assembliert werden können. Das am häufigsten rekombinant produzierte HBsAg ist S-HBsAg aus Hefesystemen, weil diese kostengünstig und skalierbar sind. Darüber hinaus ist die S-Version die Mindestvoraussetzung für die Partikelbildung und Darstellung des wichtigsten antigenen Epitop. In serologischen Tests ist nicht genau definiert, welche Version des HBsAgs zum Nachweis von Anti-HBs Antikörpern verwendet wird und welcher Organismus zur Produktion genutzt wurde. Beim Versuch, einen definierten serologischen Multiplex-Assay aufzusetzen, zeigte sich, dass kommerziell erhältliche rekombinante HBsAg-Proteine und VLPs keine effiziente Unterscheidung zwischen anti-HBs reaktiven und negativen Seren erlaubten. Daher wären reproduzierbare rekombinant hergestellte HBsAg VLPs eine überaus nützliche Referenz für serologische Assays. Hefeproduktionssysteme sind prinzipiell in der Lage, einfache posttranslationale Modifikationen (PTM) durchzuführen, jedoch glykosylieren sie das S-HBsAg nicht. Daher werden höhere eukaryotische Produktionssysteme, wie Insekten- oder Säugetierzellkulturen, benötigt, um glykosyliertes S-HBsAg zu erhalten welches dem Nativen mehr ähnelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine schnelle und einfach durchführbare reproduzierbare Produktions- und Reifungsstrategie für HBsAg VLPs etabliert. S-HBsAg wurde aus einer HEK293-Suspensionszelllinie nach transienter Genexpression extrahiert. Die VLPs wurden nicht während der Proteinproduktion gebildet. Nach der Reinigung wurde das S-HBsAg zu VLPs assembliert und die Epitope anschließend gereift. Das resultierende Material wurde biochemisch, biophysikalisch und biologisch charakterisiert und die Stabilität der Assemblierung und Antigenität beurteilt und mit kommerziellen HBsAg-Proben verglichen. Die Antigenqualität unserer S-HBsAg VLPs in einem Multiplex-serologischen Assay erwies sich als am besten geeignet zur Unterscheidung zwischen anti-HBs reaktive und negative Seren. Darüber hinaus wurde ein einfacher serologischer ELISA, welcher keine hochspezifischen Geräte erfordert, für denselben Zweck etabliert und validiert. Des Weiteren ist das HBsAg im VLP aus strukturbiologischer Sicht hochinteressant. Es wird seit rund 40 Jahren erforscht, doch erst vor kurzem wurde die erste Subnanometer-Auflösungsstruktur mit 6,3 Å durch kryogene Elektronenmikroskopie (cryoEM) gelöst. Die Partikel, die verwendet wurden, um diese Struktur aufzuklären, wurden aus infiziertem Serum isoliert. Die Strukturen der Proteinschleifen zwischen den Helices konnten jedoch auf Grund niedriger lokaler Auflösung nicht auf atomarer Ebene modelliert werden. Die externe Schleife ist von großem Interesse, weil sich in ihr das antigene Epitop befindet. HBsAg VLPs, insbesondere rekombinant hergestellte, sind nach allgemeiner Auffassung heterogen. Dennoch könnten rekombinante HBsAg VLPs für die strukturelle Aufklärung des Epitops von Vorteil sein, da sie in einer kontrollierten Umgebung hergestellt und assembliert werden, in der nur S-HBsAg vorhanden ist; native VLPs bestehen aus einer Mischung von S- und M-HBsAg mit Spuren von L-HBsAg. Rekombinante VLPs sollten daher eine einheitlichere Partikeloberfläche besitzen. Deshalb haben wir eine Vorgehensweise entwickelt, um HBsAg VLP-Proben in Hinsicht auf Homogenität und Assemblierung für strukturbiologische Untersuchungen mittels cryoEM zu verbessern. Basierend auf dem etablierten Produktions- und Reifungsprotokoll und durch die Beurteilung der Zusammensetzung beruhend auf Partikelgröße und -masse, fanden wir nativ-ähnliche rekombinanten HBsAg VLPs.
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