Aromatic prenyltransferases from Hypericum perforatum are involved in the biosynthesis of prenylated xanthones and hyperforin.

Meents, Tomke, Johanne

doi:10.24355/dbbs.084-202407021503-0

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Aromatic prenyltransferases from Hypericum perforatum are involved in the biosynthesis of prenylated xanthones and hyperforin.

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The flowering plant Hypericum perforatum is well known for its numerous pharmacological effects caused by a variety of specialized metabolites. It earns increasing popularity primarily from its effect against mild to moderate depression, which is mainly attributed to the polycyclic polyprenylated acylphloroglucinol (PPAP) hyperforin. Hyperforin is an unstable bicyclic molecule that is sensitive to light, temperature and oxidation. These properties impede the chemical synthesis and storage. In contrast, hyperforin in extracts from H. perforatum is relatively stable, making the extracts the most commonly used form of administration.

Even though the interest in hyperforin is increasing, its biosynthesis in H. perforatum remains unresolved. It was stated that the biosynthesis can be separated in two steps. The synthesis of the aromatic core is followed by decoration with isoprenoid side chains catalyzed by aromatic prenyltransferases (aPTs). Elucidation of the prenylation steps in H. perforatum would pave the way for biotechnological production of hyperforin in heterologous host organisms, thereby fostering (pre)clinical research into the pharmaceutical potential of hyperforin and its analogues.

A similar biosynthetic pattern was reported for prenylated xanthones, which also occur in Hypericum sp. and exhibit various bioactivities such as anti-inflammatory, antimicrobial, antitumor and antimalarial effects. Although the biosynthesis of their aromatic core structure was published, the number of identified PTs accepting xanthones remains relatively low.

For identification of aromatic PTs, RNA-Seq analysis of different organs of H. perforatum was performed. To identify acylphloroglucinol-specific PTs, different developmental stages of the flowering organs were analyzed, as these organs contain highest amounts of PPAPs. In contrast, enlarged xanthone amounts were reported for roots. After identification of potential PT sequences, gene expression patterns were evaluated. Four genes with increased expression in flowering organs and one gene with increased expression in roots were chosen for overexpression in yeast and activity screening.

The gene with increased expression in roots led to the identification of a xanthone-specific PT with broad acceptor and donor substrate specificities. HpPT18 was found to be active with four acceptor molecules and catalyzed both prenylation and geranylation. The favored reaction was the geranylation of 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone. Even though its physiological function in H. perforatum remains unknown, HpPT18 may pave the way for biotechnological production of isoprenoid-substituted xanthones, which are of interest for further (pre)clinical investigation.

Additionally, three acylphloroglucinol-specific PTs were identified. HpPT16 accepts the unprenylated aromatic core phlorisobutyrophenone (PIBP) and forms the monogeranylated derivative by geranylation. In contrast, HpPT3 catalyzes the prenylation of the monogeranylated monoprenylated derivative. The product is the direct precursor of hyperforin which then is accepted by HpPT9. HpPT9 catalyzes both another prenylation and an additional cyclization that yields the bicyclic hyperforin molecule.

The combination of these novel PTs with previously reported inhouse PTs led to the proposal of three possible hyperforin biosynthesis pathways in H. perforatum. For one of them, all required PTs were identified. In vitro combination of four heterologously produced PTs resulted in the successful conversion of PIBP to hyperforin. These findings provide further insights into the biosynthesis of hyperforin in H. perforatum and beyond. The four PTs along with upstream enzymes represent a biosynthetic pathway that can enable biotechnological production of hyperforin via gene transfer to host organisms.

Hypericum perforatum ist eine bereits seit langem bekannte Arzneipflanze. Die in klinischen Studien nachgewiesene Wirkung gegen milde bis moderate Depressionen hat maßgeblich zur Bekanntheit der Pflanze beigetragen. Die antidepressive Wirkung ist auf das enthaltene polyzyklische polyprenylierte Acylphloroglucinol (PPAP) Hyperforin zurückzuführen, dessen Biosynthese in H. perforatum bisher noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Bekannt ist allerdings, dass sich die Biosynthese in zwei Abschnitte aufteilen lässt. Zuerst kommt es zur Synthese der aromatischen Grundstruktur, gefolgt von dessen Dekoration mit Isoprenoid-Seitenketten. Diese Reaktionen werden durch aromatische Prenyltransferasen (PTs) katalysiert.

Vielversprechende Bioaktivitäten wurden darüber hinaus für (poly)prenylierte Xanthone berichtet. Diese Verbindungen wurden ebenfalls in Hypericum sp. nachgewiesen. Ihre Biosynthese ist, ähnlich wie bei PPAPs, in die Synthese der aromatischen Grundstruktur und deren Dekoration mit Isoprenoid-Einheiten unterteilt. Obwohl bereits einige (poly)prenylierte Xanthone aus Hypericum sp. isoliert wurden, ist die Zahl von identifizierten PTs gering. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von aromatischen PTs aus Hypericum perforatum, die in die Biosynthese von Hyperforin involviert sind oder die Prenylierung von Xanthonen katalysieren.

Mittels RNA-Seq Analyse wurden drei Acylphloroglucinol-spezifische PTs identifiziert. HpPT16 akzeptiert Phlorisobutyrophenon und katalysiert dessen Geranylierung zum monogeranylierten Derivat. HpPT3 katalysiert die Prenylierung des monogeranylierten monoprenylierten Derivats und bildet den direkten Vorläufer von Hyperforin, der dann von HpPT9 zu Hyperforin umgesetzt wird. Die Kombination dieser PTs mit zuvor in der Arbeitsgruppe getesteten PTs führte zur Identifizierung dreier möglicher Hyperforin-Biosynthesewege in H. perforatum, von denen für einen Weg alle erforderlichen PTs identifiziert sind. In vitro wurden diese vier PTs kombiniert, was zu einer erfolgreichen Umwandlung von PIBP in Hyperforin führte. Diese Ergebnisse geben erste Einblicke in die Biosynthese von Hyperforin in H. perforatum und stellen einen Biosyntheseweg dar, der durch Übertragung in Wirtsorganismen die biotechnologische Produktion von Hyperforin ermöglichen könnte.

Darüber hinaus wurde eine xanthon-spezifische PT mit breiter Affinität zu Akzeptor- und Donor-Molekülen identifiziert. HpPT18 ist mit vier Akzeptor-Substraten aktiv und katalysiert sowohl Prenylierungen als auch Geranylierungen. Die Geranylierung von 1,3,6,7-Tetrahydroxyxanthon konnte dabei als kinetisch bevorzugte Reaktion identifiziert werden. Auch wenn die physiologische Funktion von HpPT18 in H. perforatum unbekannt bleibt, könnte diese PT einen Weg für die biotechnologische Produktion von Isoprenoid-substituierten Xanthonen ebnen, die für weitere präklinische Untersuchungen von Interesse sind.