Kontext-abhängige Funktion neuer  cis-regulatorischer Elemente aus der  Arabidopsis thaliana EP3 Chitinase (ATEP3)

Arndt, Laureen, Christin

doi:10.24355/dbbs.084-202406040822-0

Thesis Wed Jun 5 2024 CC BY 4.0

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Kontext-abhängige Funktion neuer cis-regulatorischer Elemente aus der Arabidopsis thaliana EP3 Chitinase (ATEP3)

Arndt, Laureen Christin

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Kontext-abhängige Funktion neuer cis-regulatorischer Elemente aus der Arabidopsis thaliana EP3 Chitinase (ATEP3)

Cis-regulatorische Elemente spielen eine zentrale Rolle bei der transkriptionellen Regulation der Genexpression. Die WT-Box (NGACTTTN) ist eine konservierte microbe-associated molecular pattern (MAMP)-responsive cis-regulatorische Sequenz. Verschiedene WRKY‑Faktoren wurden als bindende Transkriptionsfaktoren (TFs) identifiziert. Die übliche Bindungsstelle für WRKY‑Transkriptionsfaktoren ist die W-Box TTGAC/T.

Um die funktionelle Relevanz der WT-Boxen genauer zu untersuchen, wurde im Arabidopsis Genom nach einer WT-Box-reichen 5‘ Region gesucht. Die ATEP3 Chitinase besitzt sieben WT-Boxen innerhalb der 1000 bp upstream Region. Die vier WT-Boxen, die nahe des Transkriptionsstarts liegen, zeigen eine MAMP-Responsivität im Kontext synthetischer Promotoren. Eine Veränderung der zur WT-Box Kernsequenz benachbarten Nukleotide beeinflusst die MAMP-Responsivität negativ. Die drei weiter upstream liegenden WT-Boxen zeigen keine MAMP-Responsivität. Eine Veränderung der zur WT-Box Kernsequenz benachbarten Nukleotide in den nicht-funktionellen cis-Sequenzen sorgt nur bei einer cis‑Sequenz für eine MAMP‑Responsivität. Durch den Austausch der zur WT-Box benachbarten Sequenzen wird deutlich, dass allein das Auftreten einer WT-Box nicht für eine MAMP-Responsivität ausreicht. Diese ist abhängig von den direkt benachbarten Nukleotiden und dem gesamten Sequenzkontext der WT-Box. Es handelt sich um eine Kontext-abhängige Funktion. Der Minimalpromotor der ATEP3 Chitinase ist 158 bp lang und besitzt zwei WT‑Boxen mit der Sequenz CGACTTTT. In Mutationsanalysen wird deutlich, dass beide WT‑Boxen für die MAMP-Responsivität des Minimalpromotors benötigt werden. Dies lässt auf eine kombinatorische Regulation von WT-Boxen schließen.

Die ATEP3 Chitinase ist ein mögliches Target für die Transkriptionsfaktoren WRKY50 und WRKY70. Die MAMP‑Responsivität der vier funktionellen cis-Sequenzen wird durch WRKY50 reprimiert, während WRKY70 als Aktivator der cis-Sequenzen agiert. Beide Transkriptionsfaktoren binden direkt an die WT-Boxen CGACTTTT, GGACTTTT und TGACTTTT. Für WRKY50 ist zudem eine direkte Bindung an AGACTTTG nachweisbar. Die Regulation durch WRKY70 und die direkte Bindung dieses Transkriptionsfaktors an die WT‑Box wird durch Einzel‑Nukleotid‑Austausche benachbart zur WT-Box beeinflusst.

Analysen transgener Arabidopsis thaliana Pflanzen zeigen, dass das Monitoring von Pathogeninfektionen mit WT‑Boxen möglich ist. Insbesondere die erste WT-Box der ATEP3 Chitinase eignet sich hierfür, da diese durch unterschiedliche Pathogene hochreguliert wird. In Co‑Infektionsexperimenten wird die Botrytis cinerea vermittelte Reportergenaktivität reduziert, wenn eine Co-Infektion mit Neurospora crassa vorliegt. Dies weist darauf hin, dass der nicht‑phytopathogene Pilz Neurospora crassa die Infektion der Pflanze durch den phytopathogenen Pilz Botrytis cinerea vermindert.

WT-Boxen sind neue und ungewöhnliche WRKY-Bindungsstellen und spielen somit eine wichtige Rolle bei der pflanzlichen Immunität. Entscheidend für eine MAMP-Responsivität dieser cis‑Elemente und für die Bindung von WRKY-Faktoren ist der Sequenzkontext. Gene, die keine W-, aber WT-Boxen in ihrer upstream Region besitzen, können von WRKY‑Transkriptionsfaktoren reguliert werden. Somit erweitern WT-Boxen das Repertoire an WRKY-Targets. Weiterhin können WT-Boxen Teil eines kombinatorischen Elements sein. Das Monitoring von Pathogeninfektionen in transgenen Arabidopsis thaliana Pflanzen wird durch WT-Boxen ermöglicht.

Context dependent functionality of novel cis-regulatory elements from the Arabidopsis thaliana EP3 chitinase (ATEP3)

Cis-regulatory elements play a central role in the transcriptional regulation of gene expression. The WT-boxes NGACTTTN are novel microbe-associated molecular pattern (MAMP)-responsive cis-regulatory sequences. Many of these WT boxes are WRKY transcription factor binding sites. The common binding site for WRKY transcription factors is the W-box TTGAC/T. WT boxes that do not contain thymine at the 5' end of the core sequence are uncommon WRKY binding sites.

The Arabidopsis genome was searched for a WT-box rich 5‘region to further investigate the functional relevance of WT-boxes. The ATEP3 chitinase harbors seven WT-boxes in the 1000 bp upstream region. The four most proximal WT-boxes show MAMP-responsivity in the context of synthetic promotors. A change in the nucleotides adjacent to the WT-box core sequence negatively influences the MAMP-responsivity. The three WT-boxes further upstream do not show MAMP-responsivity. The mutation of nucleotides adjacent to the WT-box core sequence in the non-functional cis-sequences ensures MAMP-responsivity in only one of those cis‑sequences. By exchanging whole sequence regions neighboring the WT-box it becomes apparent that the occurrence of a WT-box alone is not sufficient for MAMP-responsivity. This is dependent on adjacent nucleotides and the overall sequence context. WT-boxes act in a context dependent manner. The ATEP3 chitinase minimal promotor is 158 bp long and harbors two WT-boxes with the sequence CGACTTTT. Mutation analyses show that both WT-boxes are required for the MAMP-responsivity of the minimal promotor. This suggests a combinatorial regulation of WT-boxes.

The ATEP3 chitinase is a potential target for the transcription factors WRKY50 and WRKY70. The MAMP-responsivity of the four functional cis-sequences is repressed by WRKY50, while WRKY70 acts as an activator of the cis-sequences. Both transcription factors bind directly to the WT-boxes CGACTTTT, GGACTTTT and TGACTTTT. A direct binding of WRKY50 to the WT-box AGACTTTG is also detectable. The regulation through WRKY70 as well as the direct binding of WRKY70 to WT-boxes are affected by single nucleotide mutations adjacent to the WT-box.

Analyses of transgenic Arabidopsis thaliana plants show that the monitoring of pathogen infections with WT-boxes is possible. In particular, the first WT-box of the ATEP3 chitinase is suitable for this purpose, as it is upregulated by different pathogens. In co-infection experiments, the reporter gene activity mediated by Botrytis cinerea is reduced when co‑infected with Neurospora crassa. This indicates that the non-phytopathogenic fungus Neurospora crassa reduces the infection of the plant by the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea.

WT-boxes are novel and uncommon WRKY transcription factor binding sites and thus play an important role in plant immunity. The sequence context is crucial for the MAMP-responsivity of these cis-elements and for the binding of WRKY transcription factors. Genes, harboring a WT‑ but no W-box in their upstream region, can be regulated by WRKY transcription factors. Thus, WT-boxes expand the repertoire of WRKY targets. Furthermore, WT-boxes can be part of a combinatorial element. The monitoring of pathogen infections in transgenic Arabidopsis thaliana plants is enabled by WT-boxes.