Developing new strategies for efficient expression and purification of membrane proteins in insect cells

Membranproteine sind nicht nur an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt, sondern dienen auch als wichtige Stellen für die Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserreger. Die strukturelle und funktionelle Kenntnis von Membranproteinen, insbesondere von Säugetierproteinen, ermöglicht die Entwicklung neuer diagnostischen Methoden und therapeutischer Wirkstoffe. Einer der größten Engpässe für strukturelle und funktionelle Studien dieser Proteine ist jedoch ihre Verfügbarkeit in reiner, stabiler Form und ausreichender Menge. Darüber hinaus ist die heterologe Produktion von Säugetiermembranproteinen eine Herausforderung, da sie nur in geringem Maße exprimiert werden und außerdem posttranslationale Modifikationen (PTMs) essentiell sind für die korrekte Funktionalität der rek. Membranproteinen. Die Wahl von Säugetierzellen wie HEK- oder CHO-Zellen für die Produktion von Membranproteinen is aufgrund der Verfügbarkeit aller zellulären Mechanismen, die für die korrekte Faltung und den Transport in den jeweiligen subzellulären Kompartimenten erforderlich sind, eine naheliegende Wahl. Aufgrund der hohen Haltungskosten und der Schwierigkeiten bei der Skalierung wurde jedoch ein alternatives Expressionssystem für eine schnelle und skalierbare Expression benötigt. Obwohl das Baculovirus-Expressionssystem (BEVS) in Insektenzellen eine ausgezeichnete Wahl für die Produktion von Membranproteinen ist, leidet es unter verschiedenen Nachteilen wie einem begrenzten Durchsatz und zeitintensiven Schritten bei der Baculovirus-Generierung. Ausserdem, wird durch die Vireninfektion die Zellteilung gestopt und werden die Zellen umgebaut um die Produktion von Virenpartikel zu ermöglichen. Um die oben genannten Probleme zu beheben, wurde im ersten Teil dieser Doktorarbeit eine Methode zur Herstellung von Membranproteinen mit Hilfe eines Plasmid-basierten transienten Genexpressionssystems (TGE) in High Five-Insektenzellen entwickelt. Mit dieser Methode konnte das Screening für das optimale Konstrukt und die Expression von Membranproteinen in weniger als zwei Wochen durchgeführt werden. Darüber hinaus wurde mit Hilfe der TGE-Methode in High Five-Zellen eine Auswahl von sechs integralen Membranproteinen erfolgreich exprimiert und in hoher Qualität gereinigt. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Proben der integralen Membranproteine, die mit dem TGE-System hergestellt wurden, im Vergleich zu den Membranproteinproben, die mit verschiedenen anderen Systemen wie TGE in HEK, Lenti-Virustransduktion in HEK und BEVS in Sf9- und ExpiSf-Zelllinien hergestellt wurden, eine höhere Homogenität aufweisen.

Andererseits sind die exprimierten Membranproteine in eine komplexe Lipidumgebung eingebettet. Für verschiedene biophysikalische Untersuchungen ist es notwendig, diese Proteine aus Lipiddoppelschichten zu extrahieren. Die gebräuchlichste und an der weitesten verbreiteten Methode zur Extraktion von Membranproteinen ist die Verwendung von Detergenzien. Obwohl Detergenzien gut für die molekulare Dispersion und Extraktion von Membranproteinen geeignet sind, ahmen sie die Lipidumgebung nur schlecht nach und verursachen häufig Aggregation und Fehlfaltung. Außerdem ist das Zusammenspiel zwischen den Membranproteinen und der Lipiddoppelschicht nicht nur komplex, sondern auch wichtig für ihre strukturelle und funktionelle Integrität. Membranmimetische Systeme, insbesondere Nano-Lipoproteinkomplexen, haben sich zu einem wertvollen Instrument für die Untersuchung von Membranproteinen in einem nahezu natürlichen Zustand entwickelt. Daher wurden im zweiten Teil dieser Arbeit verschiedene detergenzienfreie Systeme (SMA, DIBMA und saposin A) für die Extraktion, Rekonstitution und Stabilisierung von Membranproteinen in ihrer nativen Lipidumgebung getestet. Es wurde herausgefunden, dass das saposin A (SAP-A) Nanopartikelsystem im Vergleich zu SMA und DIBMA die Membranproteine effektiver extrahieren und in stabile Lipo-Nanopartikel rekonstituieren kann.

Darüber hinaus wurde der im Rahmen dieser Dissertation entwickelte Arbeitsablauf bei der Herstellung des viralen SARS-CoV-2-Membranproteins (M-Protein) angewendet. Durch die Nutzung der entwickelten Methoden und des Arbeitsablaufs wurde das M-Protein erfolgreich exprimiert, rekonstituiert und zu SAP-A-Nanopartikeln mit M-Protein-Dimeren stabilisiert.

Zusammenfassend kann der in dieser Doktorarbeit entwickelte Arbeitsablauf genutzt werden um sowohl eukaryotische als auch virale Membranproteine unter Verwendung des Virus freien TGE-Systems in High Five-Zellen erfolgreich herzustellen. Durch die Integration des SAP-A-Nanopartikelsystems mit TGE in High-Five-Zellen können Membranproteine in Nanopartikel mit nativen Lipiden effizient stabilisiert werden.