Design of artificial glucosinolates, bio-responsive tool compounds, and studies towards epidithio-diketopiperazine siderophore hybrids
The general aim of this thesis is the design and synthesis of bio-responsive molecules that respond to specific stimuli. These stimuli function as a triggering event for the release of cargo such as drugs, dyes, or other molecules of interest, and can consist of diverse signals including enzymes, chemicals, pH changes or microenvironments of disease. They are designed to minimize side-effects in therapeutic approaches as they enable the selective release of drugs; therefore, reducing the possibility of systemic adverse events through the reduction of off-target effects and improve the pharmacokinetic properties of the drug. In the first part of this work, the chemical exploitation of different types of glucosinolates is described. It entails the fluorescent glucosinolates that have been used as tool compounds for the evaluation of GTR transport assays in oocytes of Xenopus laevis through fluorescent readout. Competition assays have shown that the uptake mechanism is the same as for the natural substrate 4MTB. Further research has shown their usefulness in decerning between the three different GTR receptors and studying how one GTR receptor can be mutated to be more like the other. Multivalent-glucosinolates have been synthesized in the interest of using multivalency to create higher potency. They were proven to still be substrates for the natural myrosinase from Sinapis alba seeds, whereas plant specifier protein from Arabidopsis thaliana (AtNSP3) was less efficient at derivatizing the isothiocyanates to nitriles, often leading to mixed ITC/CN compounds. After conducting MIC assays on several bacteria in different media, E. coli K12 seemed most capable o converting the GSLs into ITCs under anaerobic conditions. However, more assays should be conducted to assess the true potency of these compounds. Further studies into the bacterial myrosinase would be beneficial to understand when the enzyme is induced and how the structures of the mvGSLs can be optimized to be employed as antimicrobial substances. The pseudo-glucosinolates were designed based on the principle of how GSLs are converted into ITCs via a thio-Lossen rearrangement. This was accomplished through the use of an aminobenzyl-linker between the typical aglycon and the expansion of triggers that can be used. The psGSLs were synthesized and evaluated with purified enzymes. These structures can be used as biological tool compounds in fishing experiments or pool-down assays. Currently a few structures have been designed and are used as tools in such assays. Both projects were combined into multivalent pseudo-glucosinolates as curiosity arose in the use of these types of compounds as pro-pesticides. In this light, a library of twenty compounds has been synthesized so far. With a description of more triggers to be synthesized in the future. Furthermore, this extended library will be evaluated on their ability to be converted by their envisioned enzymes and how we can best employ them as pro-pesticides and biological tool compounds. The next project concerned the design and synthesis of amino-trimethyl-lock systems. Their proof-of-concept was shown through the use of chemicals, UV light, and more biologically relevant molecules. N3-TML-MURh was able to sense the gaseous signalling molecule H2S in HEK293T cells. In comparison to other activatable probes, the N3-TML system offers the advantage for application to H2S-responsive prodrug approaches as the N3-TML-CO2H moiety could also be utilized to mask the heteroatoms (N, O, S atoms) of drugs or other effectors. Two more masked H2N-TML systems were synthesized based on NO2 and b-alanine but have not yet been tested. The last project concerned a variety of approaches towards the design of epidithio-diketopiperazine (ET-DKP) siderophore hybrid derivatives. Routes based on the use of L-Lysine derivatives for the. construction of the DKP core were first favoured; however, the use of protecting groups proved cumbersome as the silyl groups provided the amine with too much shielding to participate in the peptide bond formation, regardless of coupling reagents, solvents, and temperatures used. To step away from the core build up strategies involving glycine anhydride as core were envisioned instead. This too had its own challenges to overcome. It could be worthwhile to try a different route instead that is still based on L-Lysine derivatives but less decorated at the start so that the peptide coupling can take place, followed by the cyclization. Therefore, further experiments are needed to ensure the new direction will lead to the desired compounds; future endeavours could lead to the desired ETDKPs, and their properties can be tested to verify our hypothesis for their use as antimicrobials.
Das allgemeine Ziel dieser Arbeit ist das Design und die Synthese bioresponsiver Moleküle, die auf spezifische Reize reagieren. Diese Reize fungieren als auslösendes Ereignis für die Freisetzung von Ladungen wie Arzneimitteln, Farbstoffen oder anderen interessierenden Molekülen und können aus verschiedenen Signalen bestehen, darunter Enzyme, Chemikalien, pH-Änderungen oder Mikroumgebungen von Krankheiten. Sie sollen Nebenwirkungen bei Therapieansätzen minimieren, da sie die selektive Freisetzung von Medikamenten ermöglichen; Daher wird die Möglichkeit systemischer unerwünschter Ereignisse durch die Reduzierung von Off-Target-Effekten verringert und die pharmakokinetischen Eigenschaften des Arzneimittels verbessert. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die chemische Verwertung verschiedener Arten von Glucosinolaten beschrieben. Dabei handelt es sich um fluoreszierende Glucosinolate, die als Werkzeugverbindungen für die Auswertung von GTR-Transporttests in Oozyten von Xenopus laevis durch Fluoreszenzauslesung verwendet wurden. Konkurrenztests haben gezeigt, dass der Aufnahmemechanismus derselbe ist wie für das natürliche Substrat 4MTB. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass sie nützlich sind, um zwischen den drei verschiedenen GTR-Rezeptoren zu unterscheiden und zu untersuchen, wie ein GTR-Rezeptor so mutiert werden kann, dass er dem anderen ähnlicher wird. Multivalente Glucosinolate wurden synthetisiert, um durch Multivalenz eine höhere Wirksamkeit zu erzielen. Es wurde nachgewiesen, dass sie immer noch Substrate für die natürliche Myrosinase aus Samen von Sinapis alba sind, wohingegen das Pflanzenspezifizierprotein aus Arabidopsis thaliana (AtNSP3) die Isothiocyanate weniger effizient zu Nitrilen derivatisierte, was häufig zu gemischten ITC/CN-Verbindungen führte. Nach der Durchführung von MHK-Tests an mehreren Bakterien in unterschiedlichen Medien schien E. coli K12 am besten in der Lage zu sein, die GSLs unter anaeroben Bedingungen in ITCs umzuwandeln. Es sollten jedoch weitere Tests durchgeführt werden, um die wahre Wirksamkeit dieser Verbindungen zu beurteilen. Weitere Studien zur bakteriellen Myrosinase wären hilfreich, um zu verstehen, wann das Enzym induziert wird und wie die Strukturen der mvGSLs für den Einsatz als antimikrobielle Substanzen optimiert werden können. Die pseudo-glucosinolate wurden auf der Grundlage des Prinzips entwickelt, wie GSLs über eine Thio-Lossen-Umlagerung in ITCs umgewandelt werden. Dies wurde durch die Verwendung eines Aminobenzyl-Linkers zwischen dem typischen Aglycon und der Erweiterung der verwendbaren Trigger erreicht. Die psGSLs wurden mit gereinigten Enzymen synthetisiert und bewertet. Diese Strukturen können als biologische Werkzeugverbindungen in Fischereiexperimenten oder Pool-Down-Assays verwendet werden. Derzeit wurden einige Strukturen entworfen und werden als Werkzeuge in solchen Tests verwendet. Beide Projekte wurden zu multivalenten pseudo-glucosinolaten kombiniert, da die Neugier auf die Verwendung dieser Art von Verbindungen als Pro-Pestizide geweckt wurde. Vor diesem Hintergrund wurde bisher eine Bibliothek von zwanzig Verbindungen synthetisiert. Mit einer Beschreibung weiterer Trigger, die in Zukunft synthetisiert werden sollen. Darüber hinaus wird diese erweiterte Bibliothek auf ihre Fähigkeit untersucht, von den vorgesehenen Enzymen umgewandelt zu werden, und darauf, wie wir sie am besten als Pro-Pestizide und biologische Werkzeugverbindungen einsetzen können. Das nächste Projekt befasste sich mit dem Design und der Synthese von Amino-Trimethyl-Lock-Systemen. Ihr Machbarkeitsnachweis wurde durch den Einsatz von Chemikalien, UV-Licht und biologisch relevanteren Molekülen erbracht. N3-TML-MURh konnte das gasförmige Signalmolekül H2S in HEK293T-Zellen erkennen. Im Vergleich zu anderen aktivierbaren Sonden bietet das N3-TML-System den Vorteil für die Anwendung auf H2S-responsive Prodrug-Ansätze, da die N3-TML-CO2H-Einheit auch zur Maskierung der Heteroatome (N-, O-, S-Atome) von Arzneimitteln verwendet werden könnte andere Effektoren. Zwei weitere maskierte H2N-TML-Systeme wurden auf Basis von NO2 und b-Alanin synthetisiert, aber noch nicht getestet. Das letzte Projekt befasste sich mit verschiedenen Ansätzen zum Design von Epidithio-Diketopiperazin (ET-DKP) Siderophor-Hybridderivaten. Zunächst wurden Wege bevorzugt, die auf der Verwendung von L-Lysin-Derivaten für den Aufbau des DKP-Kerns basieren; Allerdings erwies sich die Verwendung von Schutzgruppen als umständlich, da die Silylgruppen dem Amin zu viel Schutz boten, um an der Bildung der Peptidbindung teilzunehmen, unabhängig von den verwendeten Kopplungsreagenzien, Lösungsmitteln und Temperaturen. Um vom Kernaufbau abzuweichen, wurden stattdessen Strategien mit Glycinanhydrid als Kern ins Auge gefasst. Auch dies hatte seine eigenen Herausforderungen zu bewältigen. Es könnte sich lohnen, stattdessen einen anderen Weg auszuprobieren, der immer noch auf L-Lysin-Derivaten basiert, aber zu Beginn weniger dekoriert ist, damit die Peptidkopplung und die anschließende Cyclisierung stattfinden können. Daher sind weitere Experimente erforderlich, um sicherzustellen, dass die neue Richtung zu den gewünschten Verbindungen führt. Zukünftige Bemühungen könnten zu den gewünschten ET-DKPs führen, und ihre Eigenschaften können getestet werden, um unsere Hypothese für ihre Verwendung als antimikrobielle Mittel zu bestätigen.
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