Funktionelle Detektion Shigatoxin-produzierender E. coli basierend auf innovativen Förster Resonance Energy Transfer-Substraten
Shigatoxin-produzierende E. coli (STEC) sind bedeutende humanpathogene Erreger, die für Erkrankungen mit (blutigen) Durchfällen bis hin zum lebensbedrohlichen hämolytisch-urämischen Syndrom verantwortlich sind. In Deutschland werden dem RKI jährlich etwa 1.900 STEC-Infektionen und 70 HUS-Fälle gemeldet, wobei meist Kinder unter fünf Jahren betroffen sind. Die Übertragung von STEC erfolgt sowohl über den Kontakt zu Tieren als auch über kontaminierte Lebensmittel. Da STEC große Ausbrüche verursachen können, ist ihr rechtzeitiger und qualifizierter Nachweis einschließlich einer Isolatgewinnung von großer Bedeutung, der jedoch schwierig und arbeitsintensiv ist. STEC sind durch eine Vielzahl an Virulenzfaktoren, zu denen beispielsweise Adhäsions- und Kolonisationsfak-toren, Pathogenitätsinseln und Toxine gehören, sowie verschiedenen Stoffwechsel- und Oberflächen-merkmalen (O- und H-Antigene) geprägt. Da das gemeinsame Merkmal und der Hauptvirulenzfaktor der vielfältigen STEC das Shigatoxin (Stx) ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Nachweismethode für Stx entwickelt. Der Nachweis fokussiert sich speziell auf die katalytische RNA-N-Glykosylase-Aktivität von Stx, die auf den Sarcin-Ricin-Loop (SRL) der 28S ribosomalen RNA abzielt. Synthetische ssDNA-Substrate, die auf dem SRL basieren, wurden designt und mit einem Fluorophor- und Quencher-Paar verknüpft. Diese erzeugen nach der Spaltung durch Stx ein Fluoreszenzsignal auf der Grundlage des Förster-Resonanz-Energie-Transfers (FRET). Die enzymatische Stx-Aktivität der Bakterienpräparate wurde mit einem Realtime-Cycler erfasst und mit insgesamt 65 STEC-Stämmen verschiedener Serotypen und unterschiedlicher Stx-Subtypen sowie 11 Shigella-Stämmen analysiert. Die Sensitivität des Assays sowie die Spezifität wurden anhand von 29 Stämmen anderer darmpatho-gener Erreger wie Salmonella untersucht. Optimale Ergebnisse wurden mit bakteriellen Kulturüberständen oder einzelnen Kolonien für das Substrat StxSense4 nach 30 bis 60 Minuten Inkubation erreicht. Die Nachweisgrenze von 10 29 ng/mL lag im Bereich etablierter Nachweismethoden wie dem Verozell-Zytotoxizitätstest. Verschiedene Stx1-Subtypen (stx1a, stx1c und stx1d) und Stx2-Subtypen (stx2a-stx2g) sowie diverse STEC-Serotypen und Shigella wurden mit dem entwickelten Test nachgewiesen. 5 µL Kulturüberstand reichten für den Nachweis von enzymatisch aktivem Stx2 aus, während einzelne Kolonien den Nachweis sowohl von Stx1 als auch von Stx2 ermöglichten. Bei anderen darmpathogenen Erregern, die kein stx enthalten, wurde keine Fluoreszenz oberhalb der Basislinienwerte festgestellt. Der in dieser Arbeit entwickelte Test ermöglicht einen schnellen und einfachen Nachweis von STEC durch die Echtzeitanzeige der Stx-Aktivität. Daher kann er die Bewertung von STEC-Risiken, Therapie-entscheidungen und die Erkennung von Ausbrüchen und Infektionsquellen verbessern sowie die Forschung nach antimikrobiellen Mitteln vereinfachen.
Shigatoxin-producing E. coli (STEC) are important human pathogens causing diseases ranging from diarrhea to severe hemolytic uremic syndrome. In Germany, about 1900 STEC infections and 70 HUS cases are reported to the RKI annually and children under the age of five are mostly affected. As STEC are transmitted via animals, food, and water, and may produce large outbreaks, their timely and qualified detection including isolate recovery is of high importance, but challenging and labor-intense. Thus, the availability of an easy-to-perform rapid test would be a tremendous advance. STEC are a group of pathogens with high variation in marker genes such as adhesion and colonization factors, pathogenicity island and toxins, as well as metabolic and surface characteristics (O and H antigens). Since the common feature and major virulence factor of otherwise multifaceted STEC is the Shiga toxin (Stx), this study aimed to develop a detection method for Stx, specifically for its catalytic RNA-N-glycosidase activity targeting the Sarcin Ricin Loop (SRL) of 28S ribosomal RNA. To this end, synthetic ssDNA substrates mimicking the SRL were designed and linked to a fluorophore and quencher pair, which conferred a fluorescence signal after cleavage by Stx, based on the Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Stx enzymatic activity of the bacterial preparations was tested using a Realtime-Cycler for fluorescence readout. In a proof-of-principle study, the Stx activity of 65 STEC strains of distinct serogroups harboring different Stx subtypes and 11 Shigella strains was analyzed. The sensitivity of the assay was determined, and specificity was examined using 29 strains of other intestinal pathogens without Stx, such as Salmonella. Optimal results using bacterial culture supernatants or single colonies were achieved for substrate StxSense4 following 30 to 60 minutes of incubation. The detection limit of 10 29 ng/mL was within the range of established detection methods, such as the Vero cell cytotoxicity assay. Importantly, different Stx1 subtypes (stx1a, stx1c, and stx1d) and Stx2 subtypes (stx2a–stx2g), diverse STEC serotypes, and Shigella were detected. 5 µL of culture supernatants were sufficient for the detection of enzymatically active Stx2, while single colonies allowed the detection of both Stx1 and Stx2. For other enterobacteria not comprising stx, no fluorescence above baseline levels was detected. In conclusion, the here-developed assay offers rapid and facile detection of STEC based on a Realtime readout for Stx activity. Therefore, it may improve STEC risk evaluation, therapy decisions, outbreak, and source detection, and simplify research for antimicrobials.
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