Stoffwechselstrategien pathogener Bakterien und Hefen während einer Infektion

Hiller, Davina

doi:10.24355/dbbs.084-202402161226-0

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Stoffwechselstrategien pathogener Bakterien und Hefen während einer Infektion

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Zusammenfassung Teil 1- C. albicans
Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss von Itaconat auf den Stoffwechsel der Hefe C. albicans untersucht. Bislang war aus Säugerzellen bekannt, dass in Anwesenheit von Lipopolysaccharid aus der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien ein anti-mikrobielles Metabolit (Itaconat) als sogenanntes humanes Antibiotikum in Makrophagen gebildet wird. In Säugern wirkt Itaconat direkt inhibierend auf die bakterielle Isocitratlyase (Gen aceA), so dass der Glyoxylatweg nicht mehr funktionsfähig ist und das Bakterium z.B. kein Acetat mehr verwerten kann. Diese Tatsache warf die Frage auf, ob Itaconat eine ähnliche Wirkung auf den Pilz hat oder nicht. Zuerst wurden die Gene in C. albicans deletiert, die eine wichtige Funktion im alternativen Kohlenstoffabbau bei Glukosemangel haben. Die Deletion der C. albicans Glyoxylatweg-Gene ICL1 (kodiert für die Isocitratlyase) und MLS1 (kodiert für die Malatsynthase) führten bei Glukosemangel zu einem Absterben der Mutantenstämme. Der Glyoxylatweg sollte im Pilz essentiell bei einer Infektion von Makrophagen sein, da innerhalb des Phagolysosoms keine Zucker vorhanden sind. Dann wurde untersucht, ob Itaconat und deren Derivate wie Mesaconat, Dimethylitaconat oder 4-Octylitaconat eine antimykotische Wirkung haben. Es wurde eine sehr leichte Wachstumsinhibierung in Anwesenheit von Itaconat beobachtet, aber eine starke bei Mesaconat und 4-Octylitaconat. Um den in vivo Einfluss von Itaconat auf den Stoffwechsel während einer C. albicans Infektion zu untersuchen, wurde eine Metabolomanalyse der Hefe durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass das Metabolom von C. albicans deutlich verändert wurde. Es wurde beobachtet, dass einige Moleküle aus dem Zentralstoffwechsel verändert wurden. Hierbei waren die Citrat- und Glutamat-Mengen erhöht und die Glukose-, Ornithin- und 6-Phosphogluconsäuremengen reduziert. Zusätzlich wurde die Infektionsaktivität von C. albicans in murinen Makrophagen (RAW264.7) in Anwesenheit von Itaconat und dessen Derivat Mesaconat mittels FACS-Analyse untersucht. Es wurde eine Reduktion der Abtötungsaktivität von Makrophagen beobachtet, wenn Mesaconat hinzugefügt wurde. Itaconat erzielte eine andere Wirkung als Mesaconat, und zwar konnte nach Infektionen einer Mausmakrophagenzellinie (RAW264.7) mit vorheriger Itaconatzugabe keine deutliche Veränderung der Abtötungsaktivität erkannt werden. Es wurde eine Reduzierung der Zytokine IL1-ß, IL-6 und TNF-alpha in murinen Makrophagen nach einer C. albicans Infektion beobachtet. Zudem wurde erstmalig während einer Infektion mit C. albicans eine Reduzierung des intrazellulären Itaconats und eine niedrigere Irg1-Transkription festgestellt. Zusammengefaßt wurde in C. albicans gezeigt, dass zum einen Itaconat keinen negativen Einfluss auf das Wachstum des Pilzes hat und zum anderen das Metabolom und die Immunreaktion der Säugerzellen nach einer Infektion mit C. albicans veränderte. Außerdem konnten isomere Formen des Itaconats, das sogenannte Mesaconat und das 4-Octylitaconat, das Wachstum des pathogenen Pilzes inhibieren.

Zusammenfassung Teil 2- Myroides
Im zweiten Teil dieser Arbeit stand die Charakterisierung eines humanpathogenen Myroides Stammes aus dem Harnweg im Vordergrund, das bei einer Patientin mit hoher Antibiotikaresistenz symptomlos persistieren konnte. Das bakterielle Isolat (Myroides sp. A21) wurde hinsichtlich seiner Artzugehörigkeit untersucht und konnte nach einer 16S-rRNA Sequenzierung und einer MALDI-TOF Analyse eindeutig als eigene Art klassifiziert werden. Darüber hinaus wurde eine Gesamt-Volatiom-Untersuchung (mit der OLSA-Methode; open-loop-stripping-analysis) durchgeführt, bei der die flüchtigen Substanzen (hauptsächlich Ester) identifiziert wurden, die dem Bakterium die charakteristischen fruchtigen Aromen verleihen, aber deren Funktion bislang unbekannt ist. Die Antibiotikaresistenz wurde untersucht, wobei in BIOLOG^TM-Experimenten neue Sensitivitäten gegenüber bestimmten Antibiotika wie z.B. Chlortetracycline, Minocycline, Cloxacillin festgestellt wurden. Weiterhin wurde festgestellt, dass das Isolat Myroides A21 bevorzugt Aminosäuren als Kohlenstoffquelle nutzt. Dieses Pathogen war in der Lage an humane Blasenkarzinomzellen zu adhärieren und zu invasieren und konnte mit Hilfe der Urease Harnstoff degradieren. Zusammengefaßt konnte somit eindeutig eine neue Spezies mittels Sequenzierung, MALDI-TOF und Mikroskopie entdeckt werden.

Part 1- C. albicans
In the first part of the work, the influence of itaconate on the metabolism of the yeast C. albicans was investigated. Previously, it was known from mammalian cells that in the presence of lipopolysaccharide from the outer membrane of Gram-negative bacteria, an antimicrobial metabolite (itaconate) is formed as a so-called human antibiotic in macrophages. In mammals, itaconate has a direct inhibitory effect on bacterial isocitrate lyase (gene aceA), so that the glyoxylate pathway is no longer functional and the bacterium can no longer utilize acetate, for example. This fact raised the question whether itaconate has a similar effect on the fungus or not. First, the genes in C. albicans that have an important function in alternative carbon degradation in glucose deficiency were deleted. Deletion of the C. albicans glyoxylate pathway genes ICL1 (encoding isocitrate lyase) and MLS1 (encoding malate synthase) caused the mutant strains to die in glucose deficiency. The glyoxylate pathway should be essential in fungal infection of macrophages, since sugars are not present within the phagolysosome. Then it was investigated whether itaconate and its derivatives such as mesaconate, dimethylitaconate or 4-octylitaconate have antifungal activity. Very slight growth inhibition was observed in the presence of itaconate, but strong inhibition was observed with mesaconate and 4-octylitaconate. To investigate the in vivo influence of itaconate on metabolism during C. albicans infection, a metabolome analysis of yeast was performed. It was found that the metabolome of C. albicans was significantly altered. It was observed that some molecules from the central metabolism were altered. Here, the amounts of citrate and glutamate were increased and the amounts of glucose, ornithine and 6-phosphogluconic acid were decreased.
In addition, the infection activity of C. albicans in murine macrophages (RAW264.7) in the presence of itaconate and its derivative mesaconate was investigated by FACS analysis. A reduction in macrophage killing activity was observed when mesaconate was added. Itaconate achieved a different effect than mesaconate, namely no significant change in killing activity was detected after infections of a mouse macrophage cell line (RAW264.7) with prior itaconate addition. A reduction in cytokines IL1-ß, IL-6, and TNF-alpha was observed in murine macrophages following C. albicans infection. In addition, for the first time, a reduction in intracellular itaconate and lower Irg1 transcription were detected during C. albicans infection. In summary, it was shown in C. albicans that, on the one hand, itaconate had no negative effect on the growth of the fungus and, on the other hand, it altered the metabolome and immune response of mammalian cells after infection with C. albicans. In addition, isomeric forms of itaconate, known as mesaconate and 4-octylitaconate, were able to inhibit the growth of the pathogenic fungus.

Part 2- Myroides
The second part of this work focused on the characterization of a human pathogenic Myroides strain from the urinary tract, which was able to persist without symptoms in a patient with high antibiotic resistance. The bacterial isolate (Myroides sp. A21) was investigated with respect to its species affiliation and could be clearly classified as a distinct species after 16S rRNA sequencing and MALDI-TOF analysis. In addition, a total volatiome study (using the OLSA method; open-loop-stripping-analysis) was performed, identifying the volatiles (mainly esters) that give the bacterium its characteristic fruity aromas, but whose function is as yet unknown. Antibiotic resistance was investigated, and new sensitivities to certain antibiotics such as chlortetracyclines, minocyclines, cloxacillin were found in BIOLOG^TMexperiments. Furthermore, the isolate Myroides A21 was found to preferentially use amino acids as a carbon source. This pathogen was able to adhere to and invade human bladder carcinoma cells and was able to degrade urea using urease. In summary, a new species was clearly discovered by sequencing, MALDI-TOF and microscopy.