Library based approaches for SARS-CoV-2 research

Ballmann, Rico

doi:10.24355/dbbs.084-202311300914-0

Published

Library based approaches for SARS-CoV-2 research

English
German

The development of antibody therapies against SARS-CoV-2 remains a challenging task during the ongoing COVID-19 pandemic. All approved therapeutic antibodies are directed against the receptor binding domain (RBD) of the Spike protein and some of them have lost their neutralization efficacy against SARS-CoV-2 variants with mutations in the RBD region that emerged after the generation of these antibodies. Phage display is well established for the identification of epitopes from antibody responses against several diseases. Knowledge about such epitopes has been used to design and develop vaccines or novel neutralizing antibodies. To identify epitopes for SARS-CoV-2, an ORFeome phage display library representing the viral genome was generated. Open reading frames (ORFs) of the SARS-CoV-2 genome were enriched and displayed on the surface of phage particles to identify immunogenic epitopes from the immune response of COVID-19 patients. Library quality was assessed by both, Next-Generation-Sequencing (NGS) and epitope mapping of a monoclonal anti-Spike protein antibody with a known binding site. The most prominent epitope identified in this study represents parts of Spike protein´s fusion peptide (FP), located on the S2 subdomain of the protein. This site is associated with the cell entry mechanism of SARS-CoV-2 into the host cell by cleavage of the serine protease TMPRSS2 at this site. Blocking this mechanism could be a potential target for non-RBD binding therapeutic anti-SARS-CoV-2 antibodies. As mutations within the FP amino acid sequence were found to be rather rare among coronaviruses so far, this may be an advantage in the fight against future virus variants. Next, a mutagenesis library of the SARS-CoV-2 RBD was constructed by the insertion of random mutations via error-prone PCR to identify RBD mutants escaping known neutralizing antibodies. In a panning-like approach, RBD variants that are not recognized by known neutralizing antibodies but can still bind to the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) were selected. Candidates were evaluated in titration ELISA with various therapeutic anti-SARS-CoV-2 antibodies. To facilitate rapid antibody selection in future pandemics, a novel transfection approach for the fast and efficient generation of mono- to oligoclonal mammalian cells to speed up mammalian display library generation was pursued. To do so, large DNA particles that encode the gene of interest (GoI) multiple times were generated, and their utility was analyzed.

Die Entwicklung therapeutischer Antikörper gegen SARS-CoV-2 ist nach wie vor eine große Herausforderung. Die meisten der bisher entwickelten und zugelassenen Antikörper gegen das Virus wurden ursprünglich gegen die Rezeptorbindedömane (RBD) der Ursprungsvariante aus Wuhan, China entwickelt. Im Zuge der fortschreitenden Pandemie ist es immer wieder zu Mutationen innerhalb dieser Domäne gekommen, weshalb die meisten therapeutischen Antikörper ihre Neutralisationsfähigkeit gegenüber dem Virus mittlerweile verloren haben. Die Technologie des Phagen Display wurde bereits in vielen Studien genutzt um die Immunantwort von Patienten verschiedener Krankheiten zu untersuchen. Dabei konnten diverse Epitope gefunden werden, welche die Antikörper der Patienten erkennen. Mit diesen Informationen konnten sowohl Impfstoffe als auch neue Antikörper zur passiven Immunisierung entwickelt werden. In der vorliegenden Studie wurden Epitope von Antikörpern aus dem Serum genesener COVID-19 Patienten identifiziert. Dazu wurde eine ORFeome Phagen Display Bibliothek aus kodierenden Sequenzen des SARS-CoV-2 Genoms hergestellt. Dabei wurden offene Leserahmen (ORFs), also kodierende Genomsequenzen, angereichert. Die Qualität der erstellten Bibliothek wurde mittels Next-Generation-Sequencings (NGS) überprüft und das Epitop eines bereits bekannten Antikörpers evaluiert. Bei der darauffolgenden Untersuchung von Patientenseren wurde ein besonders immunogenes Epitop charakterisiert, welches eine Sequenz in der S2 Untereinheit des Spikeproteins repräsentiert. Diese Sequenz kodiert zum Teil ein Fusionspeptid (FP), das bei der Infektion und Membranfusion des Virus mit der Zielzelle eine große Rolle spielt. An dieser Stelle wird das Spikeprotein durch die Protease TMPRSS2 der Zielzelle geschnitten, was die Membranfusion initiiert. Antikörper, die gegen diese Sequenz gerichtet sind, könnten demzufolge eine Infektion abmildern oder verhindern. Bisher wurde beobachtet, dass dieser Teil des Spikeproteins vergleichsweise wenig mutiert und konserviert in anderen Coronaviren vorkommt. Anderen Studien zufolge konnten bereits neutralisierende Antikörper gegen die TMPRSS2 Zielsequenz hergestellt werden, was in dieser Arbeit ebenfalls verfolgt wurde. Um besser zu verstehen, welche Auswirkungen aktuelle und künftige Mutationen der RBD auf die Wirksamkeit von therapeutischen Antikörpern haben, wurde eine RBD-Mutationsbibliothek erstellt. Mit dieser sollen Escape-Varianten identifiziert werden. Dies sind Varianten, welche so mutiert sind, dass bekannte Antikörper nicht mehr daran binden können, eine Infektion aber immer noch möglich ist. Um eine solche RBD-Mutationsbibliothek zu erstellen, wurde die für die RBD kodiernde Sequenz mittels einer bewusst fehlerbehafteten PCR amplifiziert und in einen Phagen Display Vektor kloniert. Im Anschluss wurden Klone mit der gewünschten „Escape“ Eigenschaft selektiert und charakterisiert. Zur Erleichterung einer schnellen Antikörperauswahl während zukünftiger Pandemien wurde schließlich ein neuartiger Transfektionsansatz für die schnelle und effiziente Generierung von mono- bis oligoklonalen Gen-Bibliotheken in Säugetierzellen entwickelt. Dazu werden große DNA Partikel aus identischen Kopien von Expressionsvektoren generiert, die ein farbgebendes Protein oder einen Antikörper kodieren. Diese Partikel wurden dann zur transienten Transfektion genutzt um möglichst mono- bis oligoklonale Zellen zu generieren, die nur einen oder wenige verschiedene Antikörper auf ihrer Oberfläche präsentieren, um die Selektion monoklonaler Antikörper deutlich zu vereinfachen.