Die Oberflächen-assoziierte Motilität von Acinetobacter baumannii und ihre epigenetische Regulation durch AamA-spezifische DNA-Methylierung

Blaschke, Ulrike

doi:10.24355/dbbs.084-202311271358-0

Published

Die Oberflächen-assoziierte Motilität von Acinetobacter baumannii und ihre epigenetische Regulation durch AamA-spezifische DNA-Methylierung

German
English

Trotz des Fehlens von Flagellen sind Bakterien der Gattung Acinetobacter in der Lage sich fortzubewegen. Dies geschieht zum einen durch die Typ IV Pilus-abhängige ‚twitching’-Motilität und zum anderen durch die mechanistisch unverstandene Oberflächen-assoziierte Motilität. So sollte die vorliegende Arbeit zur Aufklärung der Oberflächen-assoziierten Motilität von Acinetobacter baumannii beitragen, eines opportunistischen Krankheitserregers.
Zunächst wurde eine A. baumannii ATCC 17978 Transposonmutanten-Bibliothek erstellt, aus welcher 30 Mutanten mit signifikanten Motilitätsdefekten identifiziert werden konnten. Diese betrafen vor allem die Genfunktionskategorien der Purin-/Pyrimidin-/Folat-Biosynthese, des Alarmon/Stress-Stoffwechsels, der RNA-Modifizierung/Regulation, der äußeren Membranproteine und der DNA-Modifikation. Um stamm- und artspezifische Merkmale zu unterscheiden, wurden ausgewählte Mutationen zusätzlich in den Stamm A. baumannii 29D2 eingeführt. Mit Hilfe der Mutantenbibliothek konnte eine DNA-Adenin-(N6)-Methyltransferase (A1S_0222) identifiziert werden, die nach ihrer Charakterisierung als AamA bezeichnet wurde. Die DNA-Methylierung in Bakterien erlaubt epigenetische Regulation und beschreibt einen reversiblen chemischen Prozess, in welchem die DNA durch das Anhängen einer Methylgruppe modifiziert wird. Die biochemische und strukturelle Charakterisierung der neuartigen A. baumannii Methyltransferase (MTase) AamA, sowie die Identifikation der spezifischen Erkennungssequenz lassen AamA als eine solitäre MTase mit distributivem Methylierungsmechanismus erscheinen. Dies steht im Gegensatz zur wohl bekanntesten solitären DNA-Adenin MTase Dam aus E. coli, welche hoch prozessiv ist und nahezu alle Erkennungsstellen methyliert. Darüber hinaus wurde eine vergleichende Multi-Omics Studie des Methyloms, Transkriptoms und Proteoms der aamA-Mutante und des Wildtyps durchgeführt. Es wurden, im Gegensatz zum planktonischen Wachstum, unter Oberflächen-assoziierter Motilität doppelt so viele m6A-methylierte AamA-spezifische Targetmotive detektiert. Auch zeigt sich eine deutliche Verbindung zwischen der Mutantenbibliothek insgesamt und den Genontologie-Gruppen der m6A-methylierten AamA-spezifischen Targetmotiven. Auf Transkriptom- und Proteom-Ebene offenbarten sich ebenfalls deutliche Einflüsse der aamA-Inaktivierung. Im Allgemeinen jedoch scheinen die Regulationsebenen Methylom, Transkriptom und Proteom, kaum miteinander gekoppelt zu sein.
Diese Ergebnisse zeigen die Einbettung der Oberflächen-assoziierten Motilität von A. baumannii in ein komplexes Regulationsnetzwerk, bei dem die AamA-vermittelte differentielle DNA-Methylierung eine zentrale Rolle zu spielen scheint.

Despite the absence of flagella, bacteria of the genus Acinetobacter are capable of locomotion. This occurs firstly through type IV pilus-dependent 'twitching' motility and secondly through surface-associated motility, which is mechanistically not understood. Thus, the present work was intended to contribute to the elucidation of the surface-associated motility of Acinetobacter baumannii, an opportunistic pathogen.
First, an A. baumannii ATCC 17978 transposon mutant library was constructed, from which 30 mutants with significant motility defects were identified. These primarily affected the gene function categories of purine/pyrimidine/folate biosynthesis, alarmone/stress metabolism, RNA modification/regulation, outer membrane proteins, and DNA modification. In order to distinguish strain- and species-specific features, selected mutations were additionally introduced into A. baumannii strain 29D2. The mutant library was used to identify a DNA adenine-(N6)-methyltransferase (A1S_0222), which was named AamA after its characterization. DNA methylation in bacteria allows epigenetic regulation and describes a reversible chemical process in which DNA is modified by the addition of a methyl group. The biochemical and structural characterization of the novel A. baumannii methyltransferase (MTase) AamA, as well as the identification of its specific recognition sequence, suggest AamA to be an orphan MTase with a distributive methylation mechanism. This is in contrast to the well-established orphan DNA adenine MTase Dam of E. coli, which is highly processive and methylates almost all recognition sites. In addition, a comparative multi-omics study of the methylome, transcriptome and proteome of the aamA-mutant and wildtype strain was performed. Twice as many m6A-methylated AamA-specific target motifs were detected under surface-associated motility, in contrast to planktonic growth. Also, a clear link between the mutant library as a whole and the gene ontology groups of m6A-methylated AamA-specific target motifs is evident. At the transcriptome and proteome levels, significant influences of aamA-inactivation were also revealed. In general, however, the regulatory levels of methylome, transcriptome, and proteome, appear to be weakly coupled.
These results demonstrate the embedding of the surface-associated motility of A. baumannii in a complex regulatory network in which AamA-mediated differential DNA methylation appears to play a central role.