Characterization of bacterial drug responses and the multispecies composition in a continuous flow biofilm model

Lember, Valentina

doi:10.24355/dbbs.084-202311091120-0

Published

Characterization of bacterial drug responses and the multispecies composition in a continuous flow biofilm model

English
German

Bacteria that are encased in biofilms show significantly enhanced resistance to antimicrobials, and therefore represent a major challenge to fight infectious diseases. Bacterial biofilms play a substantial role in chronic lung infections, especially in cystic fibrosis (CF) patients, with the Gram-negative opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa being one of the most predominant colonizers. In Europe, the likelihood of infection of the lung airways reaches 80 % for adult CF patients. Despite the increasing threat of biofilm-associated infections, adapted and biofilm-specific therapy is, however, still not applicable in routine diagnostics.

In this study, I have investigated the effect of levofloxacin (LEV) and other fluoroquinolones (FQs) on the biofilms of a GFP-tagged P. aeruginosa strain PA14 in a flow cell system via automated, time-lapse confocal laser scanning microscopy to generate biofilm-specific killing kinetics. In order to deepen the molecular understanding of the biofilm response upon the exposure to LEV, we combined CLSM image data with transcriptomics, metabolomics, reverse transcription quantitative real-time PCR and transposon sequencing (Tn-Seq) methods. Moreover, we resolved morphological and structural features by means of scanning (SEM) and transmission electron microscopy (TEM).

The results revealed that LEV treatment exhibits distinct concentration-dependent killing of PA14 biofilms. In the concentration range 20-200 µg/ml, LEV was resulting in approximately 55-80 % of dead bacteria. However, after 18 h of continuous treatment, these levels of LEV provoked an extensive increase in GFP expression going along with regrowth of parts of the biofilm population. This phenomenon was also true for other tested FQs at a corresponding multiple MIC. For a better assessment of biofilm regrowth, the three most appropriate sampling time points were selected. Applied at chosen time points RNA-seq has exhibited almost 1500 differently expressed genes in PA14 biofilms upon LEV treatments. Among them genes belonging to the SOS response pathway and R-, F-, and S-type pyocin clusters occurred to be highly upregulated, whereas chemotaxis and energy metabolism were significantly impaired. The detailed analysis of gene regulation at specific time points could decipher the GDP-mannose 6-dehydrogenase (AlgD) to be important for the biofilm-specific LEV response at 18 h. SEM analysis of LEV-treated biofilm samples showed a high proportion of elongated cells and an increased vesicle formation in PA14 wild-type. In contrast, AlgD-deficient transposon mutant PA14NR: 54588 has not undergone any visible aberrations in its biofilm structure. The characterization of central metabolic pathways of PA14 biofilm cells quantified 34 metabolites with only cadaverine and ribose pursuing an accumulative trend during exposure to LEV, while all others strongly dropped during the time course. Lastly, Tn-Seq has identified novel set of genes that contributed to enhanced fitness in our defined antibiotic environment, many of which were specific for control of phage production, biofilm formation and cell wall biogenesis.

In my thesis, I additionally focused on the establishment of a robust multispecies biofilm in a flow cell model. Hence, I based my selection on the three most relevant CF pathogens: P. aeruginosa, S. aureus and B. cepacia and could achieve a simultaneous cultivation of a biofilm comprising all of those species. Besides, I have constructed five novel fluorescent Tn7 vectors with encoded mkO1, tSapphire, mOrange, dsRedExpress and E2Crimson to further extend species composition in the future.

The results raise the awareness for the necessity of a multi-modal approach to study antibiotic resistance in bacterial biofilms to understand time-dependent molecular processes within the biofilm community upon treatment. In addition, the results indicate that conventional resistance testing in clinical settings might not deliver satisfactory results for many infections.

Im Biofilm eingebettete Bakterien zeigen eine deutlich höhere Resistenz gegenüber antimikrobiellen Medikamenten und stellen daher eine große Herausforderung für die Bekämpfung von Infektionskrankheiten dar. Bakterielle Biofilme spielen eine wesentliche Rolle bei chronischen Lungeninfektionen, insbesondere bei Patienten mit Mukoviszidose (CF). Einer der vorherrschenden Erreger bei CF-Patienten ist das Gramnegative, opportunistische Bakterium Pseudomonas aeruginosa. Die Wahrscheinlichkeit einer durch P. aeruginosa verursachten Lungeninfektion liegt bei CF-Patienten bei ca. 80 %. Trotz der zunehmenden Bedrohung durch Biofilm-assoziierte Infektionen ist eine angepasste und biofilmspezifische Therapie in der Routinediagnostik allerdings noch nicht verfügbar.

In meiner Arbeit habe ich untersucht, wie sich Levofloxacin (LEV) und andere Fluoroquinolone (FQs) auf Biofilme des GFP-markierten P. aeruginosa Stammes

PA14 auswirken. Ich habe die Biofilme in einem optimierten Durchflusszellensystem mittels automatisierter, konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie über die Zeit verfolgt und biofilmspezifische Abtötungskinetiken bestimmt. Diese Daten wurden mit Daten aus Transkriptom, Metabolom, RT-PCR und Transposon-Sequenzierung (Tn-Seq) Versuchen ergänzt, um das Verständnis der molekularen Schutzmechanismen innerhalb des Biofilms in Gegenwart von LEV besser zu verstehen. Außerdem habe ich mit Hilfe der Rasterelektronen- (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie

(TEM) strukturelle Veränderungen und morphologische Details identifiziert.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Abtötung innerhalb von PA14-Biofilmen durch LEV konzentrationsabhängig ist. In einem Konzentrationsbereich von 20-200 µg/ml tötet LEV etwa 55-80 % der Bakterien innerhalb des Biofilms ab. Trotz kontinuierlicher LEV Behandlung mit hohen Konzentrationen kommt es nach 18 Stunden jedoch zu einem starken Anstieg der GFP-Expression und damit einhergehend eines Biofilmwachstums. Auch weitere getestete FQs zeigten bei vergleichbar hohen Konzentrationen oberhalb der MHK ebenfalls ein starkes Nachwachsen im angegebenen Zeitraum. Um das Nachwachsen von Bakterien in Biofilmen besser beurteilen zu können, wurden die drei am besten geeigneten Probenahmezeiten ausgewählt. RNA-Seq Untersuchungen zu ausgewählten Zeitpunkten zeigten fast

1500 unterschiedlich exprimierte Gene in den PA14-Biofilmen nach LEV-Behandlung.

Darunter befanden sich Gene der bakteriellen SOS-Antwort und der R-, F- und S-Typ Pyocine, welche sehr stark hochreguliert waren. Auf der anderen Seite waren vor allem Chemotaxis-Gene und Gene des Energiestoffwechsels signifikant herunter reguliert.

Bei der Auswertung der zeitabhängigen Genregulation konnte ich die GDP-Mannose 6-Dehydrogenase (AlgD) identifizieren, die wichtig für die biofilmspezifische LEV-Antwort speziell nach 18 Stunden zu sein scheint. In REM-Analysen von LEV-behandelten Biofilmen konnte ein hoher Anteil an verlängerten Zellen und eine verstärkte Vesikelbildung im PA14-Wildtyp ermittelt werden. Die AlgD-defiziente Transposonmutante PA14NR: 54588 wies dagegen keine sichtbaren Veränderungen in ihrer Biofilmstruktur auf. Bei der Charakterisierung der zentralen Stoffwechselwege von PA14-Biofilmzellen wurden 34 Metaboliten quantifiziert. Allerdings konnte nur für Cadaverin und Ribose eine Zunahme unter LEV Exposition gemessen werden, während alle anderen Metabolite nach 3 Stunden stark abgenommen haben. Mittels Tn-Seq konnten zudem neuartige Gene identifiziert werden, die zu einer verbesserten Fitness in unserem Biofilm Flusskammersystem unter Antibiotikabehandlung beigetragen haben. Dazu zählen Gene, die spezifisch für die Kontrolle der Phagenproduktion, der Biofilmbildung und der Zellwandbiogenese sind.

In einem Teilprojekt dieser Arbeit habe ich mich auf die Etablierung eines robusten Multispezies-Biofilms in einem Flusskammermodell konzentriert. Die Bakterienauswahl fiel auf die drei wichtigsten CF-Erreger: P. aeruginosa, S. aureus und B. cepacia. Am erfolgreichsten für eine gute Spezies-Zusammensetzung war die zeitgleiche Kultivierung der drei Spezies. Um diesen Assay in Zukunft weiter ausbauen zu können, habe ich außerdem fünf neuartige fluoreszierende Tn7-Vektoren konstruiert, welche die Fluoreszenzproteine mkO1, tSapphire, mOrange, dsRedExpress und E2Crimson kodieren und für die gezielte, chromosomale Fluoreszenzmarkierung in Gramnegativen Bakterien eingesetzt werden können.

Die Ergebnisse haben die Notwendigkeit eines multimodalen Versuchsansatzes gezeigt, um die Wirkung von Antibiotika auf bakteriellen Biofilmen und die daraus resultierende zeitabhängige Antwort der Bakterien auf molekularer Ebene besser zu verstehen. Sie verdeutlichen außerdem einmal mehr, dass die herkömmlichen Resistenztests im klinischen Umfeld vermutlich nur unzureichende Informationen für viele Infektionen liefern.