Modelling and Model-Based Design of Optimal Processes for Enzyme-Catalysed Reactions

Hertweck, Dominik

doi:10.24355/dbbs.084-202310052012-0

Published

Modelling and Model-Based Design of Optimal Processes for Enzyme-Catalysed Reactions

English
German

Computer-assisted modelling methods are increasingly applied in research and industry to save time, cost, and material. In this work, the focus lies on the kinetic modelling of two different enzymes in order to advance our knowledge about them, and to showcase the potential of mechanistic modelling in biocatalysis as a whole. Entirely new kinetic models are formulated, existing ones are expanded upon, and they are utilised for optimisation strategies. At each stage, a look is taken back at what conclusions can be drawn for improving our molecular understanding of enzyme catalysis, and forward at how these models could be implemented for industrial process design. A core theme in all this is the effect of enzyme inactivation from different sources. Different ways to mathematically express these phenomena are derived, and the model predictions are taken advantage of to minimise the negative impact on enzyme performance.

The thesis starts by applying a systematic modelling approach to the novel unspecific peroxygenase from Agrocybe aegerita (AaeUPO). This enzyme has immense potential for industrial usage due to its oxyfunctionalisation ability. However, much like similar enzymes, AaeUPO inactivates in the presence of H₂O₂, which is needed for this oxygen-adding reaction. The kinetic model was formulated according to a detailed reaction mechanism but couldn’t be calibrated with high confidence. Simplification of the catalase side-reaction could solve this problem without forfeiting precision. Due to some missing knowledge about molecular processes for the inactivation mechanism, a semi-empirical description of enzyme inactivation was implemented to great effect. In total, the model was established based on a very small data set but was able to predict progress curve data with high precision and confidence. The model was applied for a simple H₂O₂-stat reactor strategy, which could be validated experimentally.

Moving forward, the focus shifts to benzaldehyde lyase from Pseudomonas fluorescens Biovar I (PfBAL). This is an enzyme that has been well researched in the past for its potential to produce enantiopure 2-hydroxy ketones. Due to rapid substrate-dependent inactivation, however, the potential couldn’t be realised so far. The possibility of using an existing kinetic model for the PfBAL-catalysed carboligation of benzaldehyde and propanal for reactor design is investigated. Several different dynamic optimisation cases were explored to find the intensification strategy that best maximises the formation of the target product (R)‑2-hydroxy-1-phenylbutanone. The result was a fed-batch reaction that doses both substrates at independent, dynamic rates into the reactor. The feeding profiles were too complex to generate manually but could be readily explained due to the mechanistic understanding of enzyme activity and inactivation.

Following this proof-of-concept for the model application, the existing model is expanded upon with the inclusion of pH and temperature effects. First, their individual implementation is regarded, and later on combined to form one holistic model that describes the reaction progress as a function of concentrations and the two conditions. The influence of pH on the system could be successfully modelled by separating enzyme activation and inactivation effects. Both were implemented as the protonation state of certain amino acids. While the molecular mechanism for the activation step could be confirmed with the help of model insights, the exact mechanism of the inactivation step remains unknown. The model was still able to describe the inactivation excellently but is likely a simplification of what is really happening on a molecular level. The impact of temperature changes on the reaction was expressed on a microkinetic basis, with a temperature-dependent equation for each individual parameter. This allowed for a good description of the reaction system but was hindered by experimental errors that made it impossible to separate temperature and pH changes. Fortunately, the combination of both models could fix this, and resulted in a set of differential equations that describe the PfBAL-catalysed reaction with high precision and confidence.

Lastly, all previous insights about the modelling and optimisation for PfBAL reactions are combined by using the pH- and temperature-dependent model as the basis for the design of an optimal continuous reactor. The focus lies on a reactor design that approximates optimal fed-batch performance but is simple to realise in practice. This approach allowed the rapid screening of different intensification strategies that would be impossible to design by trial and error. At the same time, the knowledge gained about the molecular processes made it easy to interpret the results, which confirmed how well-suited detailed kinetic models are for bridging academic knowledge to industrial process design.

Computergestützte Modellierungsmethoden werden zunehmend in der Forschung und Industrie eingesetzt, um Zeit, Kosten und Material zu sparen. In dieser Arbeit liegt Fokus auf der kinetischen Modellierung zweier verschiedener Enzymreaktionen, um unser Verständnis darüber zu vertiefen und ihr Potential in der angewandten Biokatalyse aufzuzeigen. Hierfür werden komplett neue kinetische Modelle formuliert, bereits existierende erweitert, und die Ergebnisse letztlich für Optimierungszwecke eingesetzt. Dabei wird versucht zu verstehen, welche Schlussfolgerungen aus den Erkenntnissen über molekulare Vorgänge gezogen werden können und gleichzeitig, wie dieses neugewonnene Wissen für das Design von industriellen Prozessen eingesetzt werden kann. Ein Leitmotiv in dieser Dissertation ist der Effekt der Enzyminaktivierung aus verschiedenen Quellen. Aus mechanistischer Betrachtung wird abgeleitet, wie diese Phänomene mathematisch ausgedrückt werden können und die resultierende Vorhersagekraft wird genutzt, um die Auswirkung von Enzyminaktivierung zu minimieren.

Diese Arbeit beginnt damit, eine systematische Vorgehensweise für die Modellierung auf die neuartige unspezifische Peroxygenase aus Agrocybe aegerita (AaeUPO) anwenden. Dieses Enzym hat aufgrund seiner Fähigkeit zur Oxyfunktionalisierung immenses Potential für den industriellen Einsatz. Allerdings inaktiviert AaeUPO stark in Anwesenheit von H₂O₂, welches für die sauerstoffaddierende Reaktion benötigt wird. Das kinetische Modell wurde auf Basis eines detaillierten Reaktionsmechanismus formuliert, konnte aber nur mit niedriger Sicherheit kalibriert werden. Eine Vereinfachung der Katalase-Nebenreaktion konnte dieses Problem beseitigen, ohne Präzision einzubüßen. Aufgrund fehlender Informationen über den molekularen Inaktivierungsprozess fiel die Entscheidung auf eine semi-empirische Beschreibung hierfür. Insgesamt konnte ein Modell aufgestellt werden, das auf einer nur kleinen Anzahl experimenteller Daten beruht und das Reaktionssystem trotzdem mit hoher Genauigkeit und Sicherheit beschreibt. Abschließend wurde das Modell eingesetzt, um eine Reaktionsführungsstrategie zu entwerfen, in der H₂O₂ konstant gehalten wird. Diese Strategie konnte auch experimentell erfolgreich umgesetzt werden.

Für den Rest dieser Arbeit verschiebt sich der Fokus auf das Enzym Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens Biovar I (PfBAL). Dieses Enzym wurde in der Vergangenheit bereits intensiv erforscht, da es für die Produktion von enantiomerenreinen 2-Hydroxyketonen eingesetzt werden kann. Aufgrund der rapiden substratbedingten Inaktivierung konnte das Potential bisher allerdings noch nicht realisiert werden. Es wird die Möglichkeit analysiert, ein existierendes Modell für die PfBAL-katalysierte Verknüpfung von Benzaldehyd und Propanal einzusetzen, um optimale Prozesse für diese Reaktion zu entwerfen. Für diese Optimierung werden verschiedene Fälle untersucht, um eine Intensivierungsstrategie zu finden, die die Bildung des Zielprodukts (R)-2-Hydroxy-1-phenylbutanon maximiert. Das Resultat war ein Fed-Batch-Reaktor, in den beide Substrate unabhängig voneinander in dynamischen Raten dosiert werden. Die zeitabhängigen Profile der Zuführung waren zu komplex, um sie manuell erstellen zu können, konnten aber aufgrund des mechanistischen Verständnisses über die Enzymaktivität und Inaktivierung leicht erklärt werden.

Aufbauend auf diesem Proof-of-concept für die Anwendbarkeit des Reaktionsmodells wird das bestehende Modell durch den Einfluss von Temperatur und pH-Wert erweitert. Zunächst werden die beiden Effekte getrennt voneinander betrachtet. Danach werden die beiden kombiniert, um ein ganzheitliches Modell zu erhalten, das den Reaktionsfortschritt in Abhängigkeit aller Konzentrationen und der Reaktionsbedingungen beschreibt. Der Einfluss des pH-Wertes auf das System konnte erfolgreich durch eine getrennte Betrachtung der Aktivität und Inaktivierung wiedergegeben werden. Beide wurden als Protonierungszustand bestimmter Aminosäuregruppen in das Modell aufgenommen. Dabei konnte der molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Enzymaktivierung durch Modellerkenntnisse bestätigt werden. Die Inaktivierung jedoch konnte nicht exakt beschrieben werden, obwohl das Modell den Effekt mit guter Präzision vorhersagen kann. Die Modellierung hier ist wahrscheinlich eine Vereinfachung von mehreren überlagerten Effekten, die zur Inaktivierung beitragen. Der Einfluss von Temperaturänderungen auf die Reaktion wurde auf mikrokinetischer Basis in das Modell eingebunden, indem jeder individuelle Parameter durch einen temperaturabhängigen Term ersetzt wurde. Dies führte zu einer guten Vorhersagekraft des Modells, wurde aber durch experimentelle Fehler gehindert, welche die Effekte von Temperatur- und pH-Wert-Einfluss überlagerten. Die Kombination der beiden Modelle konnte dieses Problem letztlich beheben und resultierte in einem System aus Differentialgleichungen, das die PfBAL-katalysierte Reaktion mit hoher Präzision und Sicherheit beschreiben kann.

Abschließend werden alle vorherigen Erkenntnisse über die Modellierung und Optimierung von Reaktionen, die durch die Benzaldehydlyase katalysiert werden, vereint. Dazu wird das Temperatur- und pH-Wert-Modell als Grundlage verwendet, um einen optimalen kontinuierlichen Reaktor zu gestalten. Der Fokus liegt dabei darauf, den Reaktor einem optimalen Fed-Batch Prozess anzunähern, gleichzeitig aber die Komplexität der tatsächlichen Realisierung gering zu halten. Diese Herangehensweise erlaubte eine schnelle Überprüfung verschiedener Intensivierungsstrategien, was unmöglich durch traditionelle laborbasierte Methoden wäre. Gleichzeitig konnten die Ergebnisse aber einfach mit den gewonnenen Erkenntnissen über die molekularen Prozesse interpretiert werden. Dies bestätigt die anfangs aufstellte These, dass detaillierte kinetische Modelle exzellent dazu geeignet sind, um eine Brücke zwischen akademischem Wissen und industriellem Prozessdesign zu schlagen.