Protein Engineering for Improved Enzyme Stability and Selectivity in Asymmetric Transformations Catalyzed by G-type Halohydrin Dehalogenases
Enzymes stand at the forefront of modern catalysis research as they facilitate asymmetric chemical transformations under environmentally friendly conditions. Halohydrin dehalogenases (HHDHs) are biocatalytically relevant enzymes as they allow the synthesis of various new C-C, C-N, C-O and C‑S bonds and thereby can produce chiral epoxides and b-substituted alcohols. In their natural reaction, they catalyze the reversible dehalogenation of vicinal halo-alcohols by the formation of the corresponding epoxides. In the reverse reaction, the epoxide ring opening, HHDHs also accept other small anionic nucleophiles such as azide, cyanide and cyanate. HheG from Ilumatobacter coccineus was the first HHDH with synthetically useful activity in the ring opening of cyclic epoxides. However, the thermal stability of HheG wild-type (WT) with an apparent melting temperature (Tm) of only 38 °C as well as the displayed enantioselectivity are insufficient for a biocatalytic application. Therefore, in this work, different protein engineering strategies were pursued to obtain HheG variants with improved (thermal) stability. While the introduction of disulfide-bonds into HheG only yielded stabilized inactive enzymes, other protein engineering strategies revealed several positions where mutation showed a positive effect on the apparent melting temperature Tm. However, most of these mutants still showed drastically reduced activity. In contrast, the T123 variants that exhibited an increased Tm(up to +12–14 K), even displayed an increase in activity (up to 5-fold) and enantioselectivity. Moreover, a flexible loop was identified in the enzyme which most likely affects substrate binding. This is the first time that dynamic behavior of HHDHs was revealed. In addition, the preparation of cross-linked enzyme crystals of HheG was successful but the cross-linking with glutaraldehyde using the soaking method led to a significant loss in activity. Unfortunately, the combination of promising mutations resulted in no mutant that displayed further increased eeP while retaining activity. All mutated positions are located in flexible regions around the nucleophile binding pocket or active site cleft whose investigation can be a good starting point for future protein engineering approaches. In addition, a newly identified putative halohydrin dehalogenase from subtype G was characterized and then tested including HheG and HheG2 in epoxide ring opening reactions with various epoxides and nucleophiles to diversify the substrate and nucleophile scope. Thereby, HheG and its homologues, were shown to offer promising activity towards 5- and 6-membered cyclic epoxides with a variation of C-, N-, O-, and S-nucleophiles which is unique among all known HHDHs. In most cases, the activity and especially the selectivity still need to be improved to produce enantiomerically pure products. However, this can be achieved by protein engineering, as already shown for HheG in a previous study. Therefore, HheG3 offers a promising possibility due to its increased stability and also co-solvent resistance compared to HheG. In summary, the results of this work contribute to the understanding of the behavior of these enzymes and form the basis for further studies to improve the stability and selectivity of the G-type homologues.
Enzyme stehen im Mittelpunkt der modernen Katalyseforschung, da sie asymmetrische chemische Umwandlungen unter umweltfreundlichen Bedingungen ermöglichen. Halohydrindehalogenasen (HHDHs) sind biokatalytisch relevante Enzyme, da sie die Synthese verschiedener neuer C-C-, C-N-, C-O- und C-S-Bindungen und damit die Herstellung chiraler Epoxide und b-substituierter Alkohole ermöglichen. In ihrer natürlichen Reaktion katalysieren sie die reversible Dehalogenierung von vicinalen Halogenalkoholen durch Bildung der entsprechenden Epoxide. In der umgekehrten Reaktion, der Epoxid-Ringöffnung, akzeptieren HHDHs auch andere kleine anionische Nukleophile wie Azid, Cyanid und Cyanat. HheG aus Ilumatobacter coccineus war das erste HHDH mit synthetisch nutzbarer Aktivität bei der Ringöffnung cyclischer Epoxide. Allerdings sind die thermische Stabilität des HheG Wildtyps (WT) mit einer scheinbaren Schmelztemperatur (Tm) von nur 38 °C und die gezeigte Enantioselektivität für eine biokatalytische Anwendung nicht ausreichend. Daher wurden in dieser Arbeit verschiedene Protein-Engineering-Strategien verfolgt, um HheG-Varianten mit verbesserter (thermischer) Stabilität zu erhalten. Während die Einführung von Disulfidbrücken in HheG nur zu stabilisierten inaktiven Enzymen führte, identifizierten andere Protein-Engineering-Strategien mehrere Positionen, deren Mutation einen positiven Effekt auf die scheinbare Schmelztemperatur Tm hatte. Die meisten dieser erzeugten Mutanten zeigten jedoch eine drastisch reduzierte Aktivität. Im Gegensatz dazu wiesen die T123-Varianten mit erhöhter Tm (bis zu +12-14 K) sogar eine Steigerung der Aktivität (bis zu 5-fach) und der Enantioselektivität auf. Außerdem wurde eine flexible Schleife im Enzym identifiziert, die wahrscheinlich die Substratbindung beeinflusst. So wurde zum ersten Mal dynamisches Verhalten von HHDHs nachgewiesen. Darüber hinaus gelang es, vernetzte Enzymkristalle von HheG herzustellen, aber die Vernetzung mit Glutaraldehyd unter Verwendung der Soaking Methode führte zu einem erheblichen Aktivitätsverlust. Leider führte die Kombination vielversprechenden Mutationen, die die Enantioselektivität beeinflussen, nicht zu einer Mutante mit weiter erhöhtem Enantiomerenüberschuss eeP und gleichbleibender Aktivität. Alle mutierten Positionen befinden sich in flexiblen Regionen um die Nukleophil-Bindungstasche oder den Spalt des aktiven Zentrums, deren Untersuchung ein guter Ausgangspunkt für zukünftige Protein-Engineering-Ansätze sein könnte. Darüber hinaus wurde eine neu identifizierte putative HHDH vom G-Subtyp charakterisiert und zusammen mit HheG und HheG2 in Epoxid-Ringöffnungsreaktionen mit verschiedenen Epoxiden und Nukleophilen getestet, um das Substrat- und Nukleophilenspektrum zu diversifizieren. Es zeigte sich, dass HheG und seine Homologen eine vielversprechende Aktivität gegenüber 5- und 6-gliedrigen zyclischen Epoxiden mit einer Variation von C-, N-, O- und S-Nukleophilen aufweisen, die unter allen bekannten HHDHs einzigartig ist. In den meisten Fällen müssen die Aktivität und insbesondere die Selektivität noch verbessert werden, um enantiomerenreine Produkte herzustellen. Dies kann jedoch durch Protein-Engineering erreicht werden, wie bereits in einer früheren Studie für HheG gezeigt wurde. HheG3 bietet daher eine vielversprechende Möglichkeit, da es im Vergleich zu HheG eine höhere Stabilität und Resistenz gegenüber Co-Lösungsmitteln aufweist. Insgesamt tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zum Verständnis des Verhaltens dieser Enzyme bei und bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Verbesserung der Stabilität und Selektivität der G-Typ Homologe.
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