Electrophysiological in-vivo characterization of regenerating Purkinje neurons in the larval zebrafish cerebellum
The work described in this study focused primarily on in-vivo studies of zebrafish Purkinje cells and Eurydendroid cells, the principle inhibitory and excitatory output neurons of the zebrafish cerebellum, respectively. Zebrafish have an impressive capability to regenerate neurons in the central nervous system (CNS), but since previous studies describing the neuroregenerative abilities of this model organism relied only on cell counts and morphological comparisons of healthy and regenerated neuronal tissue, it remained unclear whether regenerated neurons of the zebrafish CNS were actually able to recover full functionality or if these neurons recovered only partially compared to non-injured neurons. Using in-vivo electrophysiological patch-clamp recordings, we were able to demonstrate, that regenerating Purkinje cells were able to restore the functionality of their artificially ablated predecessors, by receiving input and generating output undistiguishable from non-ablated PCs, thus functionally re-integrating into the cerebellar circuit (Méndez et al., 2022). In this work, we also established a detailed time course of the olig2+ Eurydendroid cell population with respect to their physiological properties in larval zebrafish. On that basis, we were able to demonstrate that these excitatory cerebellar neurons exhibited significantly altered activity during acute PC degeneration, which returned to normal only during advanced PC regeneration. Zebrafish had already gained popularity due to their neuroregenerative abilities and their easy-to-study in-vivo brain activity. The demonstration, that regenerating neurons of the CNS completely replaced their predecessors in terms of functionality, will allow for a more in-depth analysis of the underlying processes in the future to further elucidate the fundamental cellular and molecular mechanisms of neuroregeneration. Furthermore, in this work, we established a detailed step-by-step guide, that allows highly detailed in-vivo imaging of fully functional zebrafish brains in up to 30-day-old larvae (Schramm et al., 2021), without relying on the use of pigment-inhibiting pharmaceuticals of pigment-deficient zebrafish strains. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neuronal tissue without damage. Doing so results in a freely accessible brain without hindering pigmentation of the overlaying skin, hence allowing undisturbed high-resolution real-time microscopy to investigate cellular and subcellular processes such as synaptogenesis, spine growth, dendritic elongation and axonal migration, Ca2+-transients or local mRNA expression under physiologic conditions. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological or optogenetic manipulation is feasible. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated. For example, this method allowed us to examine the myelination status of Purkinje cell axons in 4–28-day old larvae, where we found that no myelinated axons exist in the larval cerebellum. In addition, by examining vibratome sections of 3–6-month-old zebrafish brains, we found that zebrafish Purkinje cell axons are also nonmyelinated in adult zebrafish and therefore differ from mammalian Purkinje cells in this property. Our results also suggest, that olig2+ Eurydendroid cells, the principle excitatory output neurons of the zebrafish cerebellum, are myelinated in the adult zebrafish brain.
Die in dieser Studie beschriebenen Experimente konzentrierten sich in erster Linie auf die in-vivo Untersuchungen von Purkinje Zellen, welche die wichtigsten inhibitorischen Ausgangneurone des Zebrafischkleinhirns darstellen, sowie auf die Eurydendroiden Zellen, welche für den erregenden Output des Zebrafischkleinhirns verantwortlich sind. Zebrafische verfügen über eine beeindruckende Fähigkeit hinsichtlich der Regeneration von Neuronen im Zentralnervensystem (ZNS). Da frühere Studien, die sich mit den neuroregenerativen Fähigkeiten dieses Modellorganismus befassten, sich jedoch nur auf vergleichende Zellzahl-Analysen sowie die morphologische Wiederherstellung von neuronalem Gewebe stützten, blieb unklar, ob die regenerierten Neurone des Zebrafischen ZNS tatsächlich in der Lage waren, ihre volle Funktionalität wiederzuerlangen oder ob sich diese Neurone im Vergleich zu nicht-ablatierten Neuronen nur teilweise erholten. Mithilfe von elektrophysiologischen in-vivo Patch-Clamp-Messungen konnten wir zeigen, dass regenerierte Purkinje-Zellen in der Lage waren, die Funktionalität ihrer künstlich ablatierten Vorgänger wiederherzustellen, da sowohl ihr neuronaler Input als auch Output nicht mehr von gesunden PCs zu unterscheiden war, und sie sich somit vollständig in den cerebellaren Schaltkreis re-integriert hatten (Méndez et al., 2022). Im Rahmen dieser Arbeit haben wir auch einen detaillierten Zeitverlauf der olig2+ Eurydendroiden Zellpopulation hinsichtlich ihrer physiologischen Eigenschaften im larvalen Zebrafisch erstellt, der einen Zeitraum von 4-21 dpf abdeckte. Auf dessen Grundlage konnten wir zeigen, dass diese Kleinhirnneuronen während der akuten PC-Degeneration eine signifikant gesteigerte Aktivität aufwiesen, die sich erst mit voranschreiten der PC-Regeneration wieder normalisierte. Aufgrund ihrer immensen neuroregenerativen Fähigkeiten und ihrer leicht zu untersuchenden in-vivo Gehirnaktivität, besaßen Zebrafische bereits vor dieser Studie eine große Popularität. Der hier erbrachte Nachweis, dass regenerierende Neuronen ihre Vorgänger in Bezug auf die Funktionalität vollständig ersetzen, wird in Zukunft eine detailliertere Analyse der zugrunde liegenden Prozesse ermöglichen, um die grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen der Neuroregeneration weiter aufzuklären. Darüber hinaus haben wir in dieser Arbeit eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung erstellt, die hochauflösende und störungsfreie in-vivo Mikroskopie voll funktionsfähiger Zebrafisch-Gehirne in bis zu 30 Tage alten Larven ermöglicht (Schramm et al., 2021), ohne auf die Verwendung pigmenthemmender Pharmazeutika oder Pigment-defizienter Zebrafischstämme angewiesen zu sein. In Knochenfischen können sowohl Haut als auch Teile des relativ weichen Schädelknochens vorsichtig durch einen minimal invasiven chirurgischen Eingriff entfernt werden, wodurch das darunter liegende neuronale Gewebe ohne Beschädigung freigelegt wird. Dies führt zu einem frei zugänglichen Gehirn, ohne die störende Pigmentierung der darüber liegenden Haut, und ermöglicht somit hochauflösende Echtzeit-Mikroskopie zur Untersuchung zellulärer und subzellulärer Prozesse wie Synaptogenese, Spine-Wachstum, dendritische Verästelung und axonale Migration, Ca2+-Transienten oder lokale mRNA-Expression unter physiologischen Bedingungen. Darüber hinaus ist es möglich, diese Prozesse durch pharmakologische oder optogenetische Manipulationen zu untersuchen. Daher ist eine breite Anwendung dieser präparativen Mikroskopie-Technik zu erwarten. So konnten wir zum Beispiel mithilfe dieser Methode Purkinje-Zell-Axone in 4-28 Tage alten Larven auf das Vorhandensein von Myelin untersuchen, wobei wir feststellten, dass im larvalen Kleinhirn keinerlei myelinisierte Axone existieren. Darüber hinaus haben wir durch die Untersuchung von Vibratomschnitten von 3-6 Monate alten Zebrafischgehirnen herausgefunden, dass die Axone von Purkinje Zellen auch bei erwachsenen Zebrafischen nicht myelinisiert sind und sich daher in dieser Eigenschaft von Säugetier Purkinje-Zellen unterscheiden. Unsere Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass olig2+ Eurydendroide Zellen, die wichtigsten erregenden Ausgangsneuronen des Zebrafischkleinhirns, im erwachsenen Zebrafischhirn myelinisiert sind.
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