The anaerobic cyclase BchE from Rhodobacter capsulatus is a cobalamin-dependent radical SAM enzyme
Bacteriochlorophyll´s are essential cofactors involved in photosynthesis. The biosynthesis comprises a unique one-step-reaction of a fith ring (ring E) which is characteristic for bacteriochlorophylls. The reaction is catalyzed by the enzyme „Magnesium-protoporphyrin IX monomethylester cyclase“ (BchE). The function of the enzyme is mainly unknown. Bioinformatic analyses suggested that BchE may be an cobalamin dependent radical SAM enzyme. In order to characterise BchE a robust in vitro assay had to be established. For this purpose a method was developed to produce the substrate of the reaction „magnesiumprotoporphyrin IX monomethylester” (MPE) which was produced in vivo by an BchE deficient Rhodobacter capsulatus (R. capsulatus) strain. The MPE was secreted to the cultivation media and purified via chromatographic methods. The backbone of the activity tests was a cell extract from the R. capsulatus ZY6 strain which has a deficiency in one of the central early steps of the bacteriochlorophyll biosynthesis. By the addition of MPE and further cofactors to the cell extract successful BchE activity was observed with spectroscopic methods. Kinetic analyses proofed the dependency on S-Adenosylmethionine. Iron chelator´s and S-Adenosylhomocysteine inhibited the reaction. Together these information indicate the presence of a [Fe4S4] cluster which supports the idea that BchE is a radical SAM enzyme. An extensive site-directed mutagenesis approach enabled the characterization of potential ligands of the iron sulfur center and of residues which interact with the SAM and cobalamin cofactors of BchE. The site-directed mutations were introduced on plasmids to a BchE deficient R. capsulatus. The ratio of the synthesis level´s between MPE and Bacteriochlorophyll was spectroscopically determined and allowed for an assessment on the effect of each mutation on the capability of the BchE to perform the catalysis. The results support the presence of an [4Fe4S] cluster and cobalamin. Localization experiments with BchE specific antibodies and activity assays located BchE to the membrane. The activity assays performed with membrane fractions and soluble fractions indicated that there is an unknown additional soluble component required for activity. Overall this thesis should contribute to the molecular understanding of a central step in bacteriochlorophyll biosynthesis.
Bakteriochlorophylle sind als essentielle Kofaktoren an der Photosynthese beteiligt. Die Biosynthese dieser umfasst unter anderem eine einzigartige ein Schritt Reaktion für die Synthese des für Bakteriochlorophylle charakteristischen fünften Ringes (Ring E) katalysiert durch das Enzym „Magnesium-protoporphyrin IX monomethylester cyclase“ (BchE). Die Funktionsweise des BchE ist weitestgehend unverstanden. Bioinformatische Analysen geben Hinweise darauf, dass es sich um ein cobalamin abhängiges radical SAM Enzym handeln könnte. Um das Enzym zu charakterisieren sollte ein robuster in vitro Aktivitätstest etabliert werden. Hierfür wurde eine Methode weiter entwickelt um das Substrat Magnesiumprotoporphyrin IX monomethylester (MPE), dass in vivo über eine BchE defizienten Rhodobacter capsulatus (R. capsulatus) Stamm produziert wird, effizient zunächst von der Zelle in das Kultivierungsmedium zu überführen und von dort mit Chromatographischen Methoden anzureichern. Als Grundlage des Aktivitätstest diente ein Zellextrakt des R. capsulatus ZY6 Stammes. Dieser ist defizient in einem zentralen ersten Schritt der Bakteriochlorophyll Biosynthese. Durch Zugabe des Substrates und weiterer Kofaktoren konnte Spektroskopie basiert die BchE Reaktion verfolgt werden. Kinetische Analysen zeigten eine Abhängigkeit der Reaktion von dem Kofaktor S-Adenosylmethionin. Eisenchelatoren und S-Adenosylhomocysteine inhibierten die Reaktion. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf die Anwesenheit eines [4Fe4S] cluster hin und bestätigen damit die Literatur in der Annahme, dass es sich bei BchE um ein radical SAM Enzym handelt. Eine umfangreichen gezielte BchE Mutationsstudie wurde durchgeführt um die Anwesenheit von Cobalamin zu bestätigen. Durch Bioinformatische Analysen wurden potentielle Aminosäuren identifiziert, die bei der Koordination der Kofaktoren SAM und Cobalamin beteiligt sein könnten. Die Zielgerichteten Mutationen wurden in BchE Genen auf Plasmiden durchgeführt, die in einem BchE defizienten Stamm exprimiert wurden. Pigmentextrakte der Zellen wurden auf die Anwesenheit von MPE bzw. Bakteriochlorophyll hin Spektroskopisch analysiert. Das Verhältnis der MPE und Bakteriochlorophyll Konzentrationen erlaubte Rückschlüsse auf den Effekt der jeweiligen Mutation und gibt Hinweise darauf, dass auch ein Cobalamin Kofaktor an das BchE bindet. Lokalisierungsexperimente mittels BchE spezifischer Antikörper und Aktivitätstests mit Membranfraktionen haben ergeben, dass BchE zumindest and die Membran assoziiert ist oder sogar ein Membranprotein ist. Im Zuge dieser Aktivitätstests zeigte sich, dass die Reaktion von einer weiteren bisher unbekannten löslichen Komponente abhängig ist. Im Gesamten leistet diese Arbeit einen Beitrag zum molekularen Verständnis eines zentralen Schrittes in der Bakteriochlorophyll Biosynthese
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