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Protein Interaction and Inhibition of L. pneumophila Mip and Immunometabolism

ORCID
0000-0002-0156-1526
Affiliation/Institute
Institut für Mikrobiologie
Karagöz, Mustafa Safa

Legionella pneumophila, the bacterium primarily responsible for causing Legionnaires' disease, has been detected in aquatic environments and has a broad range of temperature tolerance for survival. It has the ability to infect a diverse range of host species, including animals and protozoa. L. pneumophila has developed various virulence factors, including Mip, which was the first genetically identified virulence factor of the pathogen, to facilitate its pathogenic function. Mip, a homodimeric protein located on the outer membrane, is dimerized at the N-terminal side and connected to PPIase domains at the C-terminal side via alpha helix. Mip is necessary for the early stages of infection and tissue migration through binding to collagen IV in the extracellular matrix. However, the exact mechanism by which the protein promotes infectivity is not yet understood.
In this study, the bacterial partners of Mip were identified using in vivo cross-linking for the first time in L. pneumophila. Lpc2061, SspB, and FlaA were identified as interacting partners of Mip in bacteria during the early stationary phase. The crucial regions for the interactions were also determined, with the regions of Mip binding to Lpc2061 found to be related to virulence. The biochemical results were consistent with those obtained using a novel AI-based computational software, which was employed for the first time in the study of Legionella. The identification of the interaction partners prompted the investigation of the motility of different Mip variants, and it was discovered that important virulence-related regions of Mip enhanced flagellation. This is the first report of a relationship between PPIase activity and flagellation in the literature.
Mip is a virulence factor that is also present in other pathogenic organisms. As a member of the FKBP family of PPIases, it is a promising target for the development of therapeutics. Immunosuppressive drugs rapamycin and FK506 also inhibit Mip. As a result, non-immunosuppressive analogues of FK506 have been synthesized and tested for their ability to inhibit L. pneumophila infections. For the first time, human lung tissue explants (HLTEs), which are suitable models for L. pneumophila infection, were used to evaluate the potential of FK506 analogues as therapeutic candidates. Among the candidates tested, RCD081 emerged as a particularly promising therapeutic candidate due to its ability to inhibit Mip. Its structure may serve as a model for the development of similar substances to target a range of pathogenic organisms. RCD081 is a promising candidate for further preclinical investigation as a potential treatment for L. pneumophila infections in animal models. The anti-infective effects of PPIase inhibitors and/or RCD081 were evaluated in the absence of bacterial targets, and it was observed that these substances had an off-target effect. The off-target effects of PPIase inhibitors and/or RCD081 were observed in both host and pathogen in this study. To understand the mechanism of action of PPIase inhibitors, their effects on metabolism were also investigated.
This is the first study to demonstrate the relationship between PPIase-related metabolism and pathogenicity. An increase in cytosolic branch chain amino acids was observed to be associated with a decrease in pathogenicity. The observed relationship between cytosolic branch chain amino acids and pathogenicity was found to be related to the biological lack of PPIases, as well as the off-target effects of anti-infective substances. To investigate the mechanisms of action of these substances and their anti-infective properties, the host interaction partners of Mip were identified using cell lines and HLTE infections. A novel method was used for the first time to identify host interaction partners of Mip using in vivo crosslinking techniques in bacteria. Several interacting partners from the extracellular matrix were identified using the new method, and the results were consistent with previous literature, supporting the reliability of the approach. Acetyl-CoA carboxylase 1 (ACACA), a metabolic enzyme, was selected for further investigation in relation to Mip. Mip was found to significantly decrease ACACA activity, which was rescued by the inhibition of Mip through FK506 or RCD081. This finding led to the speculation that there may be additional host metabolic functions related to Mip involved in the infection mechanism of L. pneumophila. These mechanisms suggest that L. pneumophila infections may regulate host lipid metabolism, an area that has not been extensively studied in the literature.
Despite extensive research on Mip over the past 30 years, it remains an intriguing subject of study. Recent technological advances in fields such as interactomics, metabolomics, and computational biology using artificial intelligence have contributed to a greater understanding of the role of Mip in L. pneumophila infections. However, this study raises questions for future research that will deepen our understanding of L. pneumophila infection biology, including the ways in which this prokaryote has evolved to utilize various mechanisms of eukaryotes in a parasitic relationship.

Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, wurde in aquatischen Umgebungen gefunden und zeigt eine hohe Überlebensfähigkeit in einem breiten Temperaturbereich. Die Bakterien haben die Fähigkeit, eine Vielzahl von Wirtsspezies zu infizieren, einschließlich Tiere und Protozoen. Um diese Funktion erfüllen zu können, hat L. pneumophila verschiedene Virulenzfaktoren entwickelt, von denen Mip der erste genetisch identifizierte Virulenzfaktor des Pathogens ist. Mip, dessen homodimerartige Struktur an der äußeren Membran lokalisiert ist und an der N-Terminalseite dimerisiert und über Alphahelices mit PPIase-Domänen am C-Terminal des Proteins verbunden ist, ist für die frühen Phasen der Infektion und Migration durch Gewebe bekannt, da es an Kollagen IV der extrazellulären Matrix bindet. Die Mechanismen, die für die Infektiosität von Mip verantwortlich sind, immer noch unverstanden.
In dieser Studie wurden durch die Verwendung der in vivo Crosslinking-Methode die Interaktionspartner von Mip in L. pneumophila identifiziert. Es wurde festgestellt, dass Lpc2061, SspB und FlaA Interaktionspartner von Mip in Bakterien während der Stationärphase sind. Die wichtigen Regionen für die Interaktionen wurden ebenfalls identifiziert, wobei die Regionen von Mip, die an Lpc2061 binden, als virulenzbezogene Regionen identifiziert wurden. Die Ergebnisse der biochemischen Untersuchungen stimmten mit denen überein, die mit Hilfe von neu entwickeltem, auf Künstlicher Intelligenz basierendem Computersoftware erzielt wurden, welches erstmals in dieser Studie zur Analyse von Legionella eingesetzt wurde. Die Ergebnisse der Untersuchung der Motilität von verschiedenen Mip-Varianten zeigten, dass wichtige virulenzbezogene Regionen von Mip die Flagellierung fördern. Dies ist das erste Mal, dass eine Beziehung zwischen PPIase-Aktivität und Flagellierung in der Literatur beschrieben wurde.
Mip, ein Virulenzfaktor, der auch in anderen Pathogenen vorkommt, bietet sich aufgrund seiner Eigenschaften als FKBP als Ziel für Substanzentwicklung an, ähnlich wie andere Mitglieder der PPIase-Familie. Rapamycin und FK506 sind bekannte Immunsuppressiva und Inhibitoren von Mip. In dieser Studie wurden nicht-immunsuppressive Analoga von FK506 synthetisiert und im Hinblick auf ihre Wirksamkeit gegen L. pneumophila-Infektionen getestet. Zur Auswahl dieser FK506-Analoga für die Substanzentwicklung wurden zum ersten Mal humane Lungengewebsexplantate (HLTEs), geeignete L. pneumophila-Infektionsmodelle, verwendet. Unter den Kandidaten wurde RCD081 als besonders vielversprechend ausgewählt und könnte als Vorlage für die Anwendung von Substanzen mit ähnlicher Struktur gegen verschiedene Pathogene dienen. Diese Substanz ist auch ein geeigneter Kandidat für präklinische Tierstudien zur Entwicklung als Arzneimittel gegen L. pneumophila-Infektionen. Es wurde beobachtet, dass PPIase-Inhibitoren und/oder RCD081 bei der Evaluierung der antiinfektiösen Wirkungen in Abwesenheit von bakteriellen Zielen Off-Target-Wirkung hatten.
In dieser Studie wurde zum ersten Mal der Zusammenhang zwischen PPIase, Stoffwechsel und Pathogenität gezeigt. Es wurde festgestellt, dass eine Erhöhung von zytosolischen verzweigtkettigen Aminosäuren mit einer Verminderung der Pathogenität einhergeht. Dieser Effekt wurde bei fehlenden PPIasen beobachtet und war auch im Zusammenhang mit den Off-Target-Effekten von Anti-Infektiva beobachtet worden. Die Wirkungsmechanismen dieser Substanzen wurden untersucht, indem die Interaktionspartner von Mip in Wirtzellen mittels Zelllinien und HLTE-Infektionen identifiziert wurden. Zum ersten Mal wurde in dieser Studie eine Methode eingesetzt, um die Wirt-Interaktionspartner von Mip unter Verwendung von in vivo Crosslinking-Verfahren in Bakterien zu identifizieren. Hierbei wurden Interaktionspartner von Mip in der extrazellulären Matrix identifiziert, und die Ergebnisse stimmten mit der vorherigen Literatur überein, was die Zuverlässigkeit der neuen Methode dokumentiert. Das metabolische Enzym Acetyl-CoA-Carboxylase 1 (ACACA) wurde für weitere Untersuchungen in Bezug auf Mip ausgewählt. Es wurde beobachtet, dass Mip die Aktivität von Acetyl-CoA-Carboxylase 1 (ACACA) deutlich verringerte, wobei dieser Effekt durch die Inhibition von Mip durch FK506 und/oder RCD081 rückgängig gemacht wurde. Aufgrund dieser Befunde wird vermutet, dass weitere von Mip beeinflusste metabolische Funktion in die Infektionsmechanismen von L. pneumophila involviert sind. Diese Ergebnisse legen nahe, dass L. pneumophila-Infektionen den Lipidstoffwechsel des Wirts regulieren könnten, ein Bereich, der bisher kaum untersucht wurde.
Trotz mehr als 30 Jahren Forschung bleibt Mip ein lohnendes Gebiet für weitere Studien. Die jüngsten Fortschritte in Technologien wie Interactomics, Metabolomics und KI-basierter Computational Biology haben dazu beigetragen, das Verständnis von Mip als Virulenzfaktor bei L. pneumophila-Infektionen und der Biologie von L. pneumophila als Pathogen zu verbessern. Die Studie liefert wichtige Erkenntnisse zur Rolle von Mip bei L. pneumophila Infektionen und regt weitere Forschung an, um die Infektionsmechanismen von L. pneumophila zu vertiefen, inklusive der Evolution eines Prokaryoten, der diverse Mechanismen von Eukaryoten in einer parasitären Beziehung nutzt.

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