Penicillin-bindende Proteine in Staphylococcus aureus – DER oder EIN Schlüssel zur β-Laktam-Resistenzevolution?

Sommer, Anna, Marlene

doi:10.24355/dbbs.084-202304280835-0

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Penicillin-bindende Proteine in Staphylococcus aureus – DER oder EIN Schlüssel zur β-Laktam-Resistenzevolution?

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Zur Untersuchung alternativer genetischer Determinanten, die eine β-Laktam-Resistenz verursachen, wurden vergleichende, genomische Analysen sowie genomweite Assoziationsstudien (GWAS) verwendet, um genetische Polymorphismen zu ermitteln, die mit dem MRLM (Methicillin-resistent, lacking mec) -Phänotyp in klinischen S. aureus Stämmen in Verbindung stehen. Zu diesem Zweck wurde eine repräsentative Stammsammlung aus 141 MRLM Isolaten und 142 genetisch eng verwandten, Methicillin-empfindlichen Kontrollstämmen zusammengestellt. Die Presence/Absence-basierte SCOARY GWAS Analyse konnte Mutationen im Phosphodiesterase-Gen gdpP signifikant mit dem MRLM-Phänotyp assoziieren. 131 MRLM Isolate (92,9 %) trugen gdpP-Mutationen, die zu Trunkierungen, Insertionen, Deletionen und Aminosäuresubstitutionen führten. Darüber hinaus bestätigte eine Gen-Enrichment Analyse, dass das gdpP Gen in MRLM-Stämmen im Durchschnitt 4,6-mal häufiger mutiert war als in MSSA Kontrollen. Die Mutationen in gdpP hatten keine Auswirkungen auf die Transkriptionslevel von pbp4, es konnten jedoch verringerte Zellgrößen bei MRLM Isolaten nachgewiesen werden. Vergleichende SNP-Analysen der nativen pbp1-4-Gene zeigten außerdem 57 verschiedene Aminosäuresubstitutionen in 44 Isolaten (31,2 %), die ausschließlich in MRLM-Stämmen vorkamen. Bei zwei weiteren Isolaten wurden Deletionen im pbp4-Promotor festgestellt, die bei diesen Isolaten zu einer 15-fachen bzw. 7,5-fachen Erhöhung der Transkription von pbp4 führten.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Ausbruchsszenario mit MRLM Isolaten analysiert. Es wurden insgesamt neun S. aureus-Stämme (MRLM (n=6); MSSA (n=3)) untersucht, die bei vier Frühgeborenen während eines routinemäßigen Nasenscreenings auf der neonatalen Intensivstation (NICU) eines Krankenhauses in Nordrhein-Westfalen isoliert wurden. Alle Isolate wurden dem spa-Typen t3338, dem Multi-Locus-Sequenz-Typen (MLST) ST7 und dem core-Genom MLST (cgMLST) Komplex-Typen CT20916 zugeordnet. Sie unterschieden sich voneinander in maximal 8 der 2249 genomischen Loci, die in die cgMLST-Analyse einbezogen wurden, was auf einen gemeinsamen Ursprung der Isolate hinweist. Sechs Isolate zeigten erhöhte MHKs für Oxacillin (MHK ≥ 2 mg/L) und Cefoxitin (MHK > 4 mg/L), wurden jedoch in der PCR negativ auf mec-Determinanten getestet. Fünf der MRLM Isolate hatten unterschiedliche Mutationen in gdpP, was darauf hindeutet, dass sich diese Polymorphismen bei einzelnen Patienten unabhängig voneinander entwickelt hatten und dass das ursprüngliche Indexisolat wahrscheinlich ein MSSA war. Dieses MSSA Isolat scheint in jedem Patienten unabhängig voneinander unter dem Einfluss eines bisher unbekannten Selektionsdrucks durch verschiedene Mutationen in gdpP eine Resistenz gegen β-Laktame erworben zu haben.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Mutationen in gdpP einen klinisch relevanten Mechanismus für β-Laktam-Resistenz in MRLM Isolaten darstellen. Diese Beobachtung ist von besonderer klinischer Relevanz, da MRLM leicht als MSSA fehlklassifiziert werden, was zu einer unbemerkten Ausbreitung von β-Laktam-resistenten Isolaten und anschließendem Therapieversagen führen kann.

To investigate alternative genetic determinants causing β-lactam resistance, comparative genomic analyses and genome-wide association studies (GWAS) were used to identify genetic polymorphisms associated with the MRLM (methicillin-resistant, lacking mec) -phenotype in clinical S. aureus strains. To this end, a representative strain collection was assembled from 141 MRLM isolates and 142 genetically closely related, methicillin-susceptible control strains. The presence/absence-based SCOARY GWAS analysis was able to significantly associate mutations in the phosphodiesterase gene gdpP with the MRLM phenotype. 131 MRLM isolates (92.9 %) carried gdpP mutations resulting in truncations, insertions, deletions, and amino acid substitutions. In addition, a gene-enrichment analysis confirmed that the gdpP gene was mutated on average 4.6-fold more frequently in MRLM strains than in MSSA controls. Mutations in gdpP did not affect pbp4 transcript levels, but decreased cell sizes were detected in MRLM isolates. Comparative SNP analysis of the native pbp1-4 genes also revealed 57 different amino acid substitutions in 44 isolates (31.2 %), that were exclusive to MRLM strains. Deletions in the pbp4 promoter were detected in two other isolates, resulting in a 15-fold and 7.5-fold increase in transcription of pbp4 in these isolates, respectively.

In the second part of the work, an outbreak scenario with MRLM isolates was analyzed. A total of nine S. aureus strains (MRLM (n=6); MSSA (n=3)) isolated from four preterm infants during routine nasal screening in the neonatal intensive care unit (NICU) of a hospital in North Rhine-Westphalia were studied. All isolates were assigned to spa type t3338, multi-locus sequence type (MLST) ST7, and core-genome MLST (cgMLST) complex type CT20916. They differed from each other in a maximum of 8 of the 2249 genomic loci included in the cgMLST analysis, indicating a common origin of the isolates. Six isolates showed elevated MICs for oxacillin (MIC ≥ 2 mg/L) and cefoxitin (MIC > 4 mg/L) but were tested negative for mec determinants by PCR. Five of the MRLM isolates showed different mutations in gdpP, suggesting that these polymorphisms had developed independently in the individual patients and that the original index isolate was probably an MSSA. This MSSA isolate appears to have acquired resistance to β-lactams in each patient independently under the influence of a previously unknown selection pressure by different mutations in gdpP.

In summary, this work demonstrated that mutations in gdpP represent a clinically relevant mechanism for β-lactam resistance in MRLM isolates. This observation is of particular clinical relevance, as MRLM are easily misclassified as MSSA, which can lead to unnoticed spread of β-lactam-resistant isolates and subsequent treatment failure.