Untersuchungen zur Beseitigung von Störfaktoren in der Kapillarelektrophorese – Optimierung der Präzision in der kapillar-isoelektrischen Fokussierung und Minimierung der Matrixeffekte in der mizellaren elektrokinetischen Chromatographie mit Direktinjektion
Die Kapillarelektrophorese ist eine etablierte Technik in der Pharmazeutischen Analytik, die besonders in den Bereichen Anwendung findet, in denen die Hochleistungs-Flüssigchromatographie nicht optimal geeignet ist. Hierzu gehört u. a. die Analytik von Proteinen und von Arzneistoffen in Anwesenheit von Proteinen. Dabei sind die Wechselwirkungen der Proteine mit der Kapillarwand eine ständige Herausforderung, da sie zu Veränderungen in der Trennleistung, schlechter Reproduzierbarkeit und schließlich zum Verstopfen der Kapillare führen können. Weiterhin sind Arzneistoffe häufig an Proteine gebunden und so der analytischen Erfassung entzogen. In der vorliegenden Arbeit wurden beide Aspekte jeweils anhand eines kapillarelektrophoretischen Verfahrens beleuchtet und entsprechende Problemlösungen entwickelt.
Zuerst sollte ein Zellmodell der Blut-Hirn-Schranke auf seine Eigenschaften hinsichtlich der Penetration von Arzneistoffen untersucht werden. Dazu wurden sechs Arzneistoffe mit bekannten Penetrationseigenschaften (Carbamazepin, Cimetidin, Coffein, Indometacin, Paracetamol und Propranolol) einzeln im komplex aufgebauten Nährmedium des Modells gelöst und auf das Modell aufgegeben. Nach sechs Stunden wurde jeweils der penetrierte und zurückgehaltene Anteil bestimmt, außerdem wurde die Stabilität der Arzneistoffe in dem Medium untersucht. Die hierzu verwendete mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC) erlaubt die direkte Injektion des Mediums ohne vorherige Abtrennung der Matrixbestandteile. Eine entsprechende Methode wurde für dieses Trennproblem adaptiert und hinsichtlich der zeitlichen und analytischen Anforderungen optimiert. Angepasst wurden die Wellenlänge, Druck und Dauer der Injektion, die Konzentration an Natriumlaurylsulfat (SDS), die angelegte Spannung und schließlich die Spülung der Kapillare. Dabei konnte gezeigt werden, dass die MEKC gut an unterschiedliche Matrices angepasst werden kann und dass das untersuchte Modell hinsichtlich der Arzneistoffpenetration ausreichend realistische Eigenschaften aufweist.
Bei der kapillar-isoelektrischen Fokussierung (CIEF), mit der sich der zweite Teil der Arbeit beschäftigt, liegen Proteine während der Analyse an ihrem isoelektrischen Punkt (pI) netto ungeladen und in relativ hoher Konzentration vor. Es kommt daher zu besonders starken Wechselwirkungen der Proteine untereinander und mit der Kapillare. Untersucht wurden verschiedene Möglichkeiten, die Adsorption zu verringern oder adsorbierte Proteine von der Kapillarwand zu entfernen. Dazu wurden drei gut bekannte Modellproteine (Myoglobin, Ovalbumin und β-Lactoglobulin) verwendet. Erreicht werden sollten möglichst geringe Variabilitäten der Migrationszeit und der relativen Peakfläche. Untersucht wurden zunächst verschiedene Innendurchmesser der Kapillare, wobei sich 75 µm als optimal erwiesen. Weiterhin wurden die nichtionischen Tenside Brij® 35 (1% und 2%), Tween® 20 (1%) und Tween® 80 (1%) sowie Acetonitril (10%) dem Hintergrundelektrolyten zugesetzt. Dabei traten die beiden letzten deutlich hinter Brij® und Tween 20 zurück, außerdem wurde deutlich, dass die Alterung des verwendeten Trägerampholyten das Ergebnis deutlich beeinflusst. Bei weiteren Versuchen wurden verschiedene Spülreagenzien eingesetzt (Brij® allein und in Kombination mit Propan-2-ol sowie Palmitylsulfobetain), wobei für die Migrationszeit relative Standardabweichungen im Bereich von 1,7% erreicht werden konnten. Die Verwendung eines Internen Standards verbessert die Präzision nicht, gibt aber Aufschluss über den pH-Gradienten. Schließlich konnte gezeigt werden, dass ein gewisser Spüldruck erforderlich ist, um Aggregate mechanisch von der Kapillare zu entfernen.
Capillary electrophoresis is a well-established technique in pharmaceutical analysis. It is especially applied whenever high performance liquid chromatography (HPLC) is not ideally suited, e. g., for the analytics of proteins, or of drugs in presence of proteins. Interaction between proteins and the capillary wall is a permanent challenge, as it leads to changes in separation performance, low reproducibility, and eventually capillary clogging. In this thesis, both aspects are examined and suggestions for appropriate solutions are made.
First, the drug penetration properties of cell-based blood-brain-barrier model were studied. Six drugs (acetaminophen, carbamazepine, cimetidine, caffeine, indomethacin, and propranolol) with known penetration properties were separately dissolved in the growth medium and given onto the model. After six hours, the penetrated and retained amounts of drug were determined. In addition, drug stability in the growth medium was examined. Micellar electrokinetic chromatography (MEKC) allowed direct sample injection without previous separation steps. A method has been adapted to this analytical problem and optimized to fulfil the analytical requirements and time restrictions. The following parameters were adjusted: wavelength, injection pressure and time, sodium dodecyl sulphate (SDS) concentration, voltage, and capillary rinsing. The adaptability of MEKC could be demonstrated, and the model showed sufficiently realistic properties for drug penetration.
In capillary isoelectric focusing (CIEF), being the subject of the second part of this thesis, proteins are net uncharged and in higher concentrations at their isoelectric points during analysis. This leads to particularly strong interactions between the proteins and between proteins and the capillary. Various ways of reducing adsorption and of removing adsorbed proteins from the capillary wall were investigated. Three well-known proteins (myoglobin, β-lactoglobulin, and ovalbumin) were used for this purpose. The aim should be to achieve the lowest possible variability in migration time and relative peak area. Initially, various inner diameters of the capillary were examined, with 75 µm proving to be optimal. Furthermore, the non-ionic surfactants Brij® 35 (1% and 2%), Tween® 20 (1%) and Tween® 80 (1%) and acetonitrile (10%) were added to the background electrolyte, the first two being clearly superior to the latter. It also became clear that the aging of the carrier ampholyte used significantly influences the result. Various rinsing reagents were used in further tests (Brij® alone and in combination with propan-2-ol and palmitylsulfobetaine), and relative standard deviations (RSD%) in the range of 1.7% could be achieved for the migration time. The use of an internal standard does not improve the precision. Nevertheless, it provides information about the pH gradient. Finally, it could be shown that a certain rinsing pressure is required to mechanically remove aggregates from the capillary.
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