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Entwicklung eines lagerstabilen fluorbasierten 19F-MRT-Kontrastmittels zur nicht-invasiven Darstellung inflammatorischer Ereignisse

Affiliation/Institute
Institut für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie
Keller, Thorsten

Entzündliche Veränderungen innerhalb des Gefäßsystems können durch Magnetresonanztomographie (MRT) mit Kontrastmitteln auf Emulsionsbasis, die fluorierte Substanzen als Teil der Ölphase enthalten, sichtbar gemacht werden. Trotz dieses Potenzials ist noch keine derartige Formulierung in der klinischen Anwendung verfügbar. Die Hauptursache hierfür liegt in der Herausforderung regulatorische Qualitätsanforderungen parenteraler Öl-in-Wasser (O/W)-Emulsionen insbesondere die Anforderung nach physikalischer Stabilität zu erfüllen. Daher war es das Hauptziel der vorliegenden Arbeit, ein emulsionsbasierrtes 19F-MRT-Kontrastmittel zu entwickeln, das sämtliche regulatorischen Anforderungen erfüllt und durch dessen Anwendung Entzündungen am Beispiel von Myokardinfarkten mittels MRT dargestellt werden können. Die Ergebnisse der ersten Versuche mit osmotisch stabilisierten Perfluoroctylbromid (PFOB-) Emulsionen führten aufgrund der schlechten Emulsionsqualitäten zu einer Beendigung der Weiterentwicklung auf Basis von PFOB. Durch die Verwendung des semifluorierten Alkans Perfluorhexyloctan (F6H8) und durch dessen Mischbarkeit mit MCT in jedem beliebigen Verhältnis war es möglich, mit dem Emulgator Lipoid S 75 20%-ige F6H8/MCT-Emulsionen [8/12] herzustellen, die die Anforderungen an die physikalische Stabilität erfüllten. Zudem wurden mit diesen Formulierungen erste in vivo-Testungen an einem Myokardinfarktmodell bei Ratten durchgeführt. Dabei konnte nicht nur das infarzierte Areal bildgebungstechnisch erfolgreich dargestellt werden, sondern darüber hinaus überraschenderweise eine weitere, unbeabsichtigt induzierte Entzündung des Perikards. Nach diesen vielversprechenden Ergebnissen erfolgte die Optimierung des 19F-MRT-Kontrastmittels, indem der Anteil des F6H8 von 8 % [w/V] auf 16 % [w/V] erhöht wurde. Zusammengefasst handelt es sich bei dem im Rahmen dieser Arbeit zu entwickelnden 19F MRT-Kontrastmittel um eine 20%-ige F6H8/MCT-Emulsion [16/4].

Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, die Ölphase des 19F-MRT-Kontrastmittels mit einem Nahinfrarot-Fluoreszenz-Farbstoff (NIRF-Farbstoff) zu markieren, um dadurch die Anreicherung des Kontrastmittels in entzündeten Geweben bei Ratten mit einem Herzinfarkt mithilfe der NIRF-Bildgebungstechnologie überprüfen zu können. Um sicherzustellen, dass der NIRF-Farbstoff Methyl-Propyl-Indotricarbocyanin (MP-ITCC) in vivo die gleiche Verteilung wie F6H8 zeigt, wurde dieser kovalent an Heptadecafluorundecylamin (F17) gebunden. Die ex vivo NIRF-Bilder der infarzierten Herzen von drei Versuchstieren und die entsprechenden mikroskopischen Bilder zeigten ein signifikant größeres Fluoreszenzsignal als die Kontrolle mit einem nicht infarzierten Herzen. Darüber hinaus waren infarzierte Gewebe stark mit Makrophagen infiltriert. Somit konnte die NIRF-markierte Formulierung erfolgreich verwendet werden, um die Anreicherung der F6H8/MCT-Emulsionstropfen in entzündeten Geweben zu überprüfen.

Inflammatory events in the circulatory system can be visualized by Magnetic Resonance Imaging (MRI) with emulsion-based contrast agents containing fluorinated substances as part of the oil phase. Despite this potential, none of such formulation is yet available for clinical use because of the difficulty in meeting the quality requirements of the authorities, especially the request for physical stability of parenteral oil-in-water (O/W) emulsions. Therefore, it was the principal objective of the present work to develop an emulsion-based 19F MRI contrast agent that can be visualized in inflamed tissues (exemplified by myocardial infarction) by MRI technology and that complies with all regulatory requirements. Initial experiments with osmotically stabilized perfluorooctylbromide (PFOB-) emulsions failed to meet these requirements so that the development based on PFOB was discontinued. Since experiments had shown that the semifluorinated carbon (SFC) perfluorohexyloctane (F6H8) can be imaged by 19F MRI and can be mixed with medium chain triglycerides (MCT) in any ratio, 20 % emulsions [w/V] were developed whose oil phase consisted of 8% [w/V] F6H8 and 12% MCT [w/V]. Emulsions prepared with the soybean lecithin Lipoid S 75 as emulsifier met the requirements for physically stable O/W emulsions. With such an emulsion myocardial infarction in rats, as example of inflammation, could be successfully imaged in vivo by 19F MRI. In addition, another, inadvertently induced inflammation of the pericardium could be detected using the 20% F6H8/MCT emulsion [8/12]. A final optimization of this emulsion (by increasing the percentage of F6H8 from 8 % [w/V] to 16 % [w/V]) and further stability studies led to a 20% F6H8/MCT emulsion [16/4] as newly developed 19F MRI contrast agent.

The aim of the second part of this work was to label the oil phase of the 19F MRI contrast agent with a near-infrared-fluorescence-dye (NIRF-dye) in order to use NIRF imaging technology to verify the enrichment of contrast agent in inflamed tissues in rats with myocardial infarction. To ensure that the NIRF-dye methyl-propyl-indotricarbocyanine (MP-ITCC) exhibits the same in vivo distribution as F6H8, it was covalently bound to heptadecafluoroundecylamine (F17). The ex vivo NIRF images of the infarcted hearts of three experimental animals and the corresponding microscopic images showed a significantly larger fluorescence signal than for the control with a non-infarcted heart. Furthermore, infarcted tissues were heavily infiltrated with macrophages. Thus, the NIRF-labeled formulation could successfully be used to verify the accumulation of the F6H8/MCT emulsion droplets in inflamed tissues.

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