Anti-infective agents targeting Staphylococcus aureus virulence
The ability of Staphylococcus aureus to cause a range of severe infections and the emergence of antibiotic resistance is a major health concern. The pathogenesis and host immune evasion capabilities of S. aureus are attributed to a wide array of virulence factors including cytolytic pore-forming toxins. Alpha-toxin forms a homo-heptameric pore in host cells facilitating the influx of Ca2+ and efflux of K+ and ATP. These processes lead to cell and tissue damage and are considered the prime cause of high lethality in patients having developed pneumonia caused by S. aureus. Inhibition of alpha-toxin activity by low-molecular weight chemical compounds can support therapy of these S. aureus infections. This thesis primarily aimed at characterizing the activity, efficacy and mechanism of inhibition of alpha-toxin inhibitors. The studies were complemented with the analysis of the effects of alpha-toxin on host cells. Quantitative Ca2+ influx and ATP-dependent viability assays established a lower susceptibility of A549 epithelial cells to alpha-toxin mediated damage in comparison to differentiated THP1 cells. Alpha-toxin induced apoptosis in A549 epithelial cells and upregulation of the NOTCH3 signalling pathway. The inhibitors significantly reduced the damaging effect of alpha-toxin in both phenotypic and transcriptome analyses. Time-of-addition studies and photo-affinity labelling of alpha-toxin with a photoactivatable probe were undertaken to decipher the mechanism of inhibition of the compounds. These studies revealed a direct interaction of the inhibitors with alpha-toxin. The mechanism of inhibition was further investigated by proteomic analysis, thus providing first indications on the binding region of the photo-probe to alpha-toxin. Cellular co-culture infection models with S. aureus (SH1000 and USA300) and host cells (A549 and differentiated THP1 cells) were established and characterized. The presence of alpha-toxin in the supernatant was confirmed by gel electrophoresis and western blot analysis. The damaging effect of the toxin could be detected via the determination of necrotic death (LDH release and PI staining) of host cells. The role of alpha-toxin for these cytotoxic effects was validated using alpha-toxin-deletion mutants of S. aureus. The inhibitors caused a significant reduction of necrotic cell death in the infection models underlining their application potential. Additionally, studies with systems comprising persistent intracellular S. aureus in A549 epithelial cells provided evidence on the role of alpha-toxin in intracellular S. aureus. Herein, simultaneous transcriptional response of intracellular S. aureus and infected A549 epithelial cells during late infection was studied by dual RNA-seq.
Antibiotikaresistenzen bei der Behandlung schwerer Staphylococcus aureus Infektionen sind ein großes Problem der modernen Medizin. Die Fähigkeit von S. aureus, sich dem Wirtsimmunsystem zu entziehen, werden einem breiten Spektrum von Virulenzfaktoren zugeschrieben, unter anderem zytolytischen und porenbildenden Toxinen. Alpha-Toxin bildet in Wirtszellen eine homoheptamere Pore, die den Einstrom von Ca2+ und den Ausstrom von K+ und ATP bewirken. Diese Prozesse führen zu Zell- und Gewebeschäden und gelten als Hauptursache für die hohe Sterblichkeitsrate bei S. aureus-induzierten Lungenentzündungen. Die Hemmung der Alpha-Toxin-Aktivität durch niedermolekulare Verbindungen kann die Therapie dieser Infektionen unterstützen. Ziel dieser Arbeit war es, Auswirkungen von Alpha-Toxin auf Wirtszellen zu analysieren und die Aktivität, die Wirksamkeit und den Mechanismus der Hemmung von Alpha-Toxin-Inhibitoren zu untersuchen. Quantifizierung von Ca2+-Einstrom und Zellviabilitätstest ergaben eine geringere Anfälligkeit von A549-Epithelzellen gegenüber Alpha-Toxin-vermittelten Schäden im Vergleich zu differenzierten THP1-Zellen. Alpha-Toxin löste in A549-Zellen Apoptose und eine Hochregulierung des NOTCH3-Signalwegs aus. Die Inhibitoren verringerten die schädigende Wirkung von Alpha-Toxin sowohl in phänotypischen, als auch in Transkriptomanalysen erheblich. Um den Hemmungsmechanismus durch die Verbindungen zu entschlüsseln, wurden Photoaffinitätsmarkierungen des Toxins mit einer aktivierbaren Sonde durchgeführt. Dabei wurde eine direkte Wechselwirkung der Inhibitoren mit Alpha-Toxin gezeigt. Der Mechanismus wurde durch eine Proteomanalyse untersucht, die erste Hinweise auf die Bindungsregion der Photosonde an Alpha-Toxin lieferte. Co-Kultur-Infektionsmodelle von S. aureus (SH1000 und USA300) mit Wirtszellen (A549 und differenzierte THP1-Zellen) wurden etabliert und charakterisiert. Die Existenz von Alpha-Toxin im Überstand wurde durch Gelelektrophorese und Western-Blot-Analyse bestätigt. Die Wirkung des Toxins konnte durch die Bestimmung von Nekrose (LDH-Freisetzung und PI-Färbung) der Wirtszellen nachgewiesen werden. Die Rolle des Alpha-Toxins für diese zytotoxischen Effekte wurde mit Hilfe von Alpha-Toxin-Deletionsmutanten validiert. Die Inhibitoren bewirkten eine signifikante Verringerung des Zelltods in den Infektionsmodellen, was ihr Anwendungspotenzial unterstreicht. Darüber hinaus lieferten Studien mit A549-Epithelzellen Hinweise auf die Rolle von Alpha-Toxin bei intrazellulären S. aureus. Dabei wurde die simultane transkriptionelle Reaktion von intrazellulären S. aureus und infizierten A549-Epithelzellen während einer späten Infektion mittels dualer RNA-seq untersucht.
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