Evaluation of the Measurement Uncertainty in Ligand Binding Assays with Focus on Mobility Shift Affinity Capillary Electrophoresis
As an analytical technique for the analysis of intermolecular interactions, Ligand binding assays are essential tools for biochemical research and in the early stages of drug development. Specific theories, like binding models or drug profiles, are derived based on the determined binding parameters, such as dissociation constants. However, the quality and reliability of such theories are highly dependent on the precision and trueness of the analytical results. For this reason, the measurement uncertainty of ligand binding assays was investigated using mobility shift affinity capillary electrophoresis (ms-ACE) as a model. The uncertainty evaluation included the development of a generally applicable ms-ACE method to determine the interaction between the transport protein human serum albumin and several small drugs. It could be shown that the developed method is suitable for the complete quantitative binding parameter determination of R- and S-Amlodipine, L-Tryptophan, Carbamazepine, and S-Verapamil. Furthermore, the interaction with the molecules D-Tryptophan, Propranolol, and R-Verapamil could be analyzed qualitatively. It was impossible to measure the binding towards Ibuprofen, Lidocaine, and Sitagliptin. The main reasons for the non-applicability are electrophoretic properties of Ibuprofen and a too weak binding affinity of Lidocaine and Sitagliptin. The data of a large-scale comparative study was investigated statistically. The general variability of the effective mobility determination was assessed using the complete data. Furthermore, the best estimates for each binding parameter were calculated by non-linear mixed effects model analysis. The standard deviation of the measured effective mobilities was 0.118 ·10−9 m2 · s−1 · V −1. Specific analytical factors, such as the difference in the binding partner’s electrophoretic properties, the position, and the distribution of the measurement points, were investigated. Based on the results of the comparative study, a Monte Carlo Simulation study covering the whole design space was derived by Design of Experiments. Here, the precision and trueness of the binding parameters were analyzed in terms of the simulated experimental conditions. After simulating all possible factor combinations, the responses were fitted to a second-degree polynomial model with single interaction terms by partial least square regression. Using the regression coefficients and derived variable importance scores, the impact of each factor on the response was evaluated. According to the design evaluation, three main aspects should be considered when developing an ms-ACE experiment. The most important factor is working with a sufficiently high normalized maximal response range design. Here, values in the corridor between 50 and 175 should be targeted. The following relevant factor is the maximal measurement concentration. It should be chosen as high as possible. The last aspect considers the distribution of the measurement points. When it is possible, an optimal design, such as an A- or E-optimal design, should be used. In addition, a user-friendly computer program was introduced. With that program, it is possible to simulate a user-defined ms-ACE experiment and predict the conditional measurement uncertainty of measurement under the selected experimental conditions.
Ligandenbindungstest zur Untersuchung von intermolekularen Interaktionen sind sehr relevant unter anderem für die biochemische Grundlagenforschung oder bei der Entwicklung von neuartigen Medikamenten. Bindungsparameter, wie zum Beispiel die Affinitätskonstante, sind wichtige Messwerte bei der Herleitung von bestimmten Theorien. Diese Abhängigkeit führt dazu, dass die Qualität bzw. die Verlässlichkeit derartiger Theorien sehr stark abhängig von der Präzision und Richtigkeit dieser Assays ist. Aufgrund dessen wurde die Messunsicherheit von Ligandenbindungstest am Beispiel von mobility shift affinity capillary electrophoresis (ms-ACE) in dieser Arbeit untersucht. Es wurde eine allgemein einsetzbare ms-ACE Methode zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen humanem Serumalbumin und unterschiedlichen kleinen Molekülen entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass diese Methode für die vollständig quantitative Bestimmung von R- und S-Amlodipin, L-Tryptophan, Carbamazepin und S-Verapamil geeignet ist. Die Moleküle D-Tryptophan, Propranolol und R-Verapamil konnten nur qualitativ gemessen werden. Für die Wirkstoffe Ibuprofen, Lidocain und Sitagliptin war die Methode nicht geeignet. Die Hauptgründe für diese Nichteinsetzbarkeit sind die elektrophoretischen Eigenschaften von Ibuprofen sowie die zu geringe Bindungsaffinität von Lidocain und Sitagliptin. Die Ergebnisse einer vergleichenden Studie wurden statistisch beurteilt. Hierbei wurden alle grundsätzlich messbaren Interaktionspartner mittels der entwickelten Messmethode untersucht und die Variabilität der gemessenen effektiven Mobilität statistisch bewertet. Zusätzlich wurden die Bindungsparameter mittels non-linear mixed effects model analysis berechnet. Die durchschnittliche Standardabweichung der gemessenen effektiven Mobilitäten konnte auf 0.118 ·10−9 · m2 · s−1 · V −1 geschätzt werden. Der Einfluss bestimmter analytischer Faktoren, wie zum Beispiel die elektrophoretischen Eigenschaften der Bindungspartner oder die Position und Verteilung der Messpunkte wurde untersucht. Basierend auf den Ergebnissen der vergleichenden Studie wurden mittels Design of Experiments alle möglichen Faktorkombinationen des gesamten Design Spaces ermittelt. Anschließend wurde die Präzision und die Richtigkeit der Bindungsparameter für alle Faktorkombinationen mittels Monte Carlo Simulationen bestimmt und per Partial Least Squares Regression ausgewertet. Die Stärke des Einflusses der Faktoren wurde anhand der ermittelten Regressionskoeffizienten und abgeleiteten Variable Importance Scores bewertet. Hierbei haben sich vor allem drei Faktoren als besonders wichtig herausgestellt. Zum einen ist das die relative Differenz zwischen den elektrophoretischen Eigenschaften der Analyten und dessen Komplex und zum anderen die maximal eingesetzte Ligandenkonzentration sowie die Verteilung der Messpunkte. Für Ersteres sollten normalized maximal response ranges zwischen 50 und 175 erreicht werden. Bezüglich der Messkonzentrationen sollte zum einen ein hoher maximal Wert und zum anderen ein A- oder E-optimales Design angestrebt werden. Zusätzlich wurde Computerprogramm zur Schätzung der Messunsicherheit vorgestellt. Hierbei ist es dem User möglich, bestimmte Messbedingungen zu definieren und die dazu passende bedingte Messunsicherheit zu simulieren.
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