Untersuchungen zu Proteinen der Phytoalexin-Biosynthese bei Krankheiten des Apfels und Wirkungen von Biphenyl-Derivaten auf die Honigbiene
In der Familie Rosaceae und deren Gattung Malus befindet sich die ökonomisch bedeutsame Art Malus x domestica, der kultivierte Apfel. Eine gefürchtete Krankheit des Apfels, Feuerbrand, wird durch den bakteriellen Erreger Erwinia amylovora verursacht. Große Probleme bereitet auch die Nachbaukrankheit (ARD), die auf ein verändertes Bodenmikrobiom zurückgeht. Zur Pathogenbekämpfung erzeugt die Pflanze Abwehrstoffe. Deren Biosyntheseweg sowie die beteiligten Enzyme sind bereits bekannt. Ebenso ist die Lokalisation weniger Enzyme bereits untersucht und ließ ein Metabolon vermuten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden immunchemische und immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt, um den Beitrag eines putativen Metabolons zu klären. Hierbei wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um ein lösliches Antigen eines an der Phytoalexin-Biosynthese beteiligten membranständigen Cytochrom P450-Enzyms, Biphenyl-4-Hydroxylase (B4H), zu erzeugen und dagegen Antikörper zu generieren. Aufarbeitungs- und Aufreinigungsverfahren wurden an B4H-Varianten untersucht, die um den Membrananker oder noch weitreichender N- und/oder C-terminal trunkiert waren. Ebenso wurden repräsentative Peptide in silico entwickelt und spezifische Antikörper dagegen erzeugt. Bei der Untersuchung der entsprechenden Antikörper konnten die geforderten Qualitätsanforderungen jedoch nicht erfüllt werden. Ein immunchemischer Nachweis und die immunhistochemische Lokalisation der B4H gelangen weder in Feuerbrand- noch in ARD-betroffenen Pflanzen. Die Frage nach einem Metabolon unter Beteiligung der B4H konnte somit nicht beantwortet werden. Für ein weiteres an der Phytoalexin-Biosynthese beteiligtes Enzym, die O-Methyltransferase 1 (OMT1), lagen bereits Antikörper vor. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Spezifität dieser Antikörper eindeutig nachgewiesen werden. Die Expression der OMT1 in ARD-betroffenen Wurzeln wurde gezeigt. Eine immunhistochemische Lokalisation konnte jedoch nicht realisiert werden. Ebenso konnten für ein weiteres Enzym, die O-Methyltransferase 2 (OMT2), erfolgreich Antikörper erzeugt werden, die den geforderten Qualitätsanforderungen entsprachen. Zudem gelang ein immunchemischer Nachweis in Feuerbrand-infizierten Pflanzen. Der Expressionsverlauf konnte näher untersucht werden. Eine immunhistochemische Lokalisation in Feuerbrand-infizierten Sprossen gelang aber nicht. Ebenso gelang weder ein immunchemischer noch ein immunhistochemischer Nachweis in ARD-betroffenen Wurzeln. Darüber hinaus wurde die Aktivität eines putativen Promotors der Biphenyl-Synthase mit Hilfe eines Fusionskonstrukts unter Verwendung bereits erzeugter transgener Pflanzen von Malus x domestica Pinova untersucht. Fluoreszenzmikroskopisch gelang der Nachweis in den Axillarknospen von Feuerbrand-infizierten Sprossen. Schließlich wurde im Rahmen dieser Arbeit die akute orale und akute Kontakttoxizität von Biphenyl-Derivaten an der Honigbiene untersucht. Hierbei zeigten die untersuchten Biphenyle unterschiedlich ausgeprägte toxische Eigenschaften. An einer besonders hervortretenden Verbindung konnte zudem der LD50-Wert der akuten oralen Toxizität ermittelt werden.
The family Rosaceae and its genus Malus include the economically important species Malus x domestica, the cultivated apple. A dreaded disease of apple, fire blight, is caused by the bacterial pathogen Erwinia amylovora. Another challenge is apple replant disease (ARD), which is due to an altered soil microbiome. To combat the pathogens, the plant produces defence compounds. The biosynthetic pathway of these metabolites and the enzymes involved are already known. Likewise, the localization of a few enzymes is studied and suggests a metabolon. In this work, immunochemical and immunohistochemical investigations were carried out to clarify the contribution of the putative metabolon. Various approaches were pursued to generate a soluble antigen of biphenyl 4-hydroxylase involved in phytoalexin biosynthesis as a membrane-bound CYP enzyme and to generate appropriate antibodies. Workup and purification procedures were investigated using B4H variants, which were truncated for the membrane anchor or further for N- and/or C-terminal segments. Moreover, representative peptides were developed in silico and used to generate specific antibodies. However, the required quality standards were not met when examining the corresponding antibodies. Immunochemical detection and immunohistochemical localization of B4H failed in both fire blight- and ARD-affected plants. Thus, the question of a metabolon involving B4H could not be answered. Antibodies were already available for another enzyme involved in phytoalexin biosynthesis, O methyltransferase 1 (OMT1). In this work, the specificity of these antibodies was clearly demonstrated. The expression of OMT1 was detected in ARD-affected roots. Its immunohistochemical localization could not be realized. For another enzyme, O-methyltransferase 2 (OMT2), antibodies were successfully generated and met the required quality standards. Immunochemical detection succeeded in fire blight-infected plants. The temporal expression pattern was studied in more detail. Immunohistochemical localization in fire blight-infected shoots was not successful. This was also true for immunochemical and immunohistochemical detection, which failed in ARD-affected roots. Furthermore, the activity of a putative promoter of biphenyl synthase was studied using a fusion construct and previously generated transgenic plants of Malus x domestica Pinova. Via fluorescence microscopy, the detection was successful in the axillary buds of fire blight-infected shoots. Finally, the acute oral and acute contact toxicity of biphenyl derivatives was investigated in honey bees. The biphenyls studied showed different degrees of toxicity. In addition, the LD50 value of the acute oral toxicity was successfully determined for a particularly prominent compound.
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