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The interplay between interferon-stimulated gene products and herpesviruses : role of the antiviral protein ZAP during human herpesvirus infection

ORCID
0000-0002-8674-1525
Affiliation/Institute
Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI)
González Pérez, Ana Cristina

Interferon-stimulated gene products (ISGs) play a crucial role in early infection control, thus elucidating their mechanism of action could uncover future therapeutic targets. This work investigated selected ISGs for their possible role during human cytomegalovirus (HCMV) infection, a β-herpesvirus associated with high morbidity in immunosuppressed individuals and congenitally infected newborns. To this end, a flow cytometry assay was established to monitor infection following two complementary approaches: (1) the generation of stable cell lines overexpressing the selected ISGs, and (2) the creation of knockout (KO) cell lines in primary human fibroblasts (HFF-1) by Cas9 genome editing. This identified the zinc finger antiviral protein ZAP as a highly interesting candidate of study during early HCMV infection due to its strong modulatory effect. ZAP antagonizes several RNA viruses by binding to CG-rich RNA sequences and mediating their degradation by the exosome machinery, while its role during DNA virus infection was not well understood. To determine the effect of ZAP on the course of HCMV infection, a global temporal analysis comparing the transcriptome and proteome in wildtype versus ZAP KO cells was performed. This demonstrated that the presence of ZAP resulted in reduced viral transcript and protein levels, as well as decelerated the progression of HCMV infection. Reconstitution assays showed that both major isoforms of ZAP, short (ZAP-S) and long (ZAP-L), negatively affect HCMV replication. In addition, metabolic RNA labeling combined with high-throughput sequencing (SLAM-seq) revealed that most of the late gene expression changes derived from the general attenuation of HCMV. Remarkably, at early stages of infection, ZAP destabilized a distinct subset of viral transcripts, with those expressed from the poorly-characterized UL4-UL5 HCMV locus being the most significantly affected. Enhanced crosslinking and immunoprecipitation in combination with RNA sequencing analysis (eCLIP-seq) identified these viral transcripts as direct targets of ZAP, indicating that ZAP mediates their degradation by direct interaction. Nevertheless, preliminary results comparing infection between WT virus and different mutants suggest that the delay observed in the presence of ZAP could be exerted by means other than ZAP-specific binding and destabilization of UL4 and UL5.
Regarding the target specificity of ZAP, this work shows its ability to bind not only to CG, but also to other cytosine-rich RNA sequences. Moreover, infection with mutant isoforms of ZAP with impaired CG-binding capacity of its second zinc finger (ZnF2) demonstrated the non-essential role of ZnF2 in controlling HCMV infection.
In summary, this work illustrates the complex relationship between ISGs and viruses and provides evidence of an important antiviral role for ZAP during early host defense against the DNA virus HCMV. It also expands the knowledge about the binding specificity of ZAP, reveals direct viral and cellular targets of ZAP during early HCMV infection, and explores their impact during infection. Lastly, this study provides new insights into the effect of ZAP on the α-herpesviruses herpes simplex virus type 1 and type 2, as well as varicella-zoster virus, paving the way for future research work.

Interferon-stimulierte Genprodukte (ISGs) spielen eine entscheidende Rolle bei der frühen Infektionskontrolle, so dass die Aufklärung ihrer Wirkungsmechanismen zukünftige therapeutische Ziele aufdecken könnte. In dieser Arbeit wurden ausgewählte ISGs auf ihre Rolle während einer Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) untersucht, einem β-Herpesvirus, das mit einer hohen Morbidität bei immunsupprimierten Personen und kongenital infizierten Neugeborenen in Verbindung steht. Zu diesem Zweck wurde eine durchflusszytometrische Analyse zur Quantifizierung der Infektion auf der Basis von zwei komplementären Ansätzen etabliert: (1) stabile Zelllinien, die die ausgewählten ISGs überexprimieren, und (2) Cas9-editierte Knockout (KO)-Zelllinien. Dabei wurde das Zinkfinger-Antivirale-Protein (ZAP) als interessanter Kandidat identifiziert, der aufgrund seiner starken modulatorischen Wirkung während der frühen Phase der HCMV-Infektion weiter untersucht wurde. ZAP inhibiert eine Reihe von RNA-Viren, indem es an CG-reiche RNA-Sequenzen bindet und deren Abbau durch die Exosomenmaschinerie vermittelt, während seine Rolle bei der Infektion mit DNA-Viren nicht gut verstanden war. Um die Auswirkung von ZAP auf den Verlauf der HCMV-Infektion zu bestimmen wurde eine globale zeitliche Analyse durchgeführt, bei der das Transkriptom und Proteom in Wildtyp- und ZAP-KO-Zellen verglichen wurden. Dabei zeigte sich, dass ZAP zu einer Verringerung der viralen Transkript- und Proteinmengen führte und das Fortschreiten der HCMV-Infektion verlangsamte. Rekonstitutionsversuche zeigten, dass beide Haupt-Isoformen von ZAP, die kurze (ZAP-S) und die lange (ZAP-L) Isoform, die HCMV-Replikation negativ beeinflussen. Darüber hinaus ergab die metabolische RNA-Markierung in Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (SLAM-seq), dass die meisten der späten Genexpressionsänderungen auf die allgemeine Abschwächung der HCMV Infektion zurückzuführen sind. Bemerkenswerterweise destabilisierte ZAP in den frühen Stadien der Infektion eine bestimmte Untergruppe von viralen Transkripten, wobei diejenigen, die vom nur wenig charakterisierten HCMV-Locus UL4-UL5 exprimiert werden, am stärksten betroffen waren. Mittels „verstärkte Quervernetzung und Immunpräzipitation in Kombination mit RNA-Sequenzierungsanalysen“ (eCLIP-seq) wurden diese viralen Transkripte als direkte Interaktionspartner von ZAP identifiziert, was darauf hindeutet, dass ZAP ihren Abbau durch direkte Interaktion vermittelt. Vorläufige Ergebnisse eines Vergleichs der Infektion zwischen WT HCMV und verschiedenen HCMV Mutanten deuten jedoch darauf hin, dass die in Gegenwart von ZAP beobachtete Verlangsamung der Infektion durch andere Mittel als die ZAP-spezifische Bindung und Destabilisierung von UL4 und UL5 bewirkt werden könnte.
Was die Zielspezifität von ZAP betrifft so zeigt diese Arbeit, dass es nicht nur an CG, sondern auch an andere cytosinreiche RNA-Sequenzen binden kann. Darüber hinaus hat die Infektion mit mutierten Isoformen von ZAP, bei denen die CG-Bindungskapazität des zweiten Zinkfingers (ZnF2) beeinträchtigt ist, gezeigt, dass ZnF2 keine essentielle Rolle für die antivirale Funktion von ZAP bei der HCMV-Infektion spielt.
Zusammenfassend veranschaulicht diese Arbeit die komplexe Beziehung zwischen ISGs und Viren und liefert Beweise für eine wichtige antivirale Rolle von ZAP während der frühen Immunabwehr gegen das DNA-Virus HCMV. Sie liefert ebenfalls neue Erkenntnisse über die Bindungsspezifität von ZAP, zeigt direkte virale und zelluläre Ziele von ZAP während der frühen HCMV-Infektion auf und untersucht deren Auswirkungen während der Infektion. Schließlich liefert diese Studie neue Erkenntnisse über die Wirkung von ZAP auf die α-Herpesviren Herpes simplex Typ 1 und Typ 2 sowie das Varizella zoster Virus, und ebnet damit den Weg für künftige Forschungsarbeiten.

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