Carnitine metabolism in the human gut: Characterization of the two-component carnitine monooxygenase CntAB from Acinetobacter baumannii
The gut microbiome came into focus in recent years, since the related metabolic processes such as bacterial trimethylamine formation were linked to the development of cardiovascular diseases. The Rieske-type carnitine monooxygenase from Acinetobacter baumannii catalyzes the oxygen dependent conversion of dietary L-carnitine into TMA and malic semialdehyde. The enzyme is composed of the reductase component CntB and the catalytic unit CntA.
In the first part of this study, the enzymatic conversion of L-carnitine by the two-component carnitine monooxygenase was analyzed. A robust enzymatic activity assay was established and a specific enzymatic activity of 771 ± 67 nmol min-1 mg-1 was determined. The consumption of NAD(P)H and production of TMA was confirmed. Furthermore, meldonium and allicin were initially characterized as inhibitors of carnitine monooxygenase.
The second part of this work describes the detailed characterization of the recombinantly produced enzymes CntB and CntA from A. baumannii. CntB is a NAD(P)H-dependent reductase carrying a noncovalently bound FMN cofactor which is held in place by residues Asp-75 and Ser-82. The plant-type [2Fe-2S] cluster is coordinated by Cys-267, Cys-272, Cys-275, and Cys-305. The Rieske-type CntA protein contains a Rieske-type [2Fe-2S] cluster, coordinated by residues Cys-86, His-88, Cys-106, and His-109 and a mononuclear iron center with protein ligands His-208, His-213, and Asp-323. Residue Glu-205 might play a fundamental role for the redox relay of CntA. This bridging glutamate might facilitate the intermolecular electron transfer between the subunits of the trimeric CntA protein.
Finally, the obtained results provided significant insights into the electron transfer mechanism of carnitine monooxygenase. A chain of closely spaced redox relays enables the NAD(P)H-dependent activation of O2 with subsequent formation of TMA, malic semialdehyde, and water. NAD(P)H facilitates the initial reduction of the flavin by two electrons. Subsequently, single-electron transfer from FMNH2 to the [2Fe-2S]2+ cluster is observed, resulting in a FMNH*/[2Fe-2S]+ state. Reduced CntB now enables the two-electron intersubunit electron transfer onto CntA by transient protein-protein interaction. Single-turnover experiments revealed the resulting FMN/[2Fe-2S]2+ state for CntB and the [2Fe-2S]+/[Fe]2+ state for CntA was experimentally determined after. Molecular oxygen can be activated by CntA in a two-electron transfer process with subsequent release of the oxygenase in the CntA [2Fe-2S]2+/[Fe]3+ redox state.
Das Mikrobiom im Darm rückte in den letzten Jahren immer mehr in den Fokus der Wissenschaft, seitdem die Zusammenhänge zwischen bakterieller Trimethylamin (TMA) Bildung und Kardiovaskulären Erkrankungen aufgeklärt wurden. Das Rieske-Enzym Carnitin Monooxygenase von Acinetobacter baumannii katalysiert den sauerstoffabhängigen Abbau von L-Carnitin zu TMA und Malonsäure Semialdehyd. Das Enzym setzt sich aus der Reduktase CntB und der katalytisch aktiven Komponente CntA zusammen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der enzymatische Abbau von L-Carnitin durch die Carnitin Monooxygenase analysiert. Ein reproduzierbarer enzymatischer Assay wurde entwickelt und eine spezifische Aktivität von 771 ± 67 nmol min-1 mg-1 bestimmt. Die Verwendung von NAD(P)H und die gleichzeitige Bildung von TMA wurde bestätigt. Weiterhin wurden die beiden Stoffe Meldonium und Allicin als Inhibitoren der Reaktion identifiziert.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die beiden Enzyme CntA und CntB aus Acinetobacter baumannii rekombinant produziert und im Detail charakterisiert. CntB stellte sich als NAD(P)H abhängige Reduktase heraus. Der nicht kovalent gebundenen FMN Kofaktor wird durch die beiden Aminosäurereste Asp-75 and Ser-82 stabilisiert. Das pflanzenähnliche [2Fe-2S] Cluster wird durch die Aminosäurereste Cys-267, Cys-272, Cys-275, and Cys-305 koordiniert. Das CntA Protein enthält ein Rieske-Typ [2Fe-2S] Cluster, welches durch die Aminosäurereste Cys-86, His-88, Cys-106, and His-109 koordiniert wird. Das mononukleare Eisenzentrum wird durch die Aminosäurereste His-208, His-213, and Asp-323 ligandiert. Der Aminosäurerest Glu-205 spielt eine fundamentale Rolle für die Redox-Reaktion von CntA. Es ist ebenfalls an dem intermolekularen Elektronentransfer zwischen den CntA Proteinen im Trimer-Komplex beteiligt.
Letztlich gaben die erzielten Ergebnisse Rückschlüsse auf den Mechanismus des Elektronentransfers der Carnitin Monooxygenase. Die NAD(P)H abhängige O2 Aktivierung und die anschließende Bildung von TMA, Malonsäure Semialdehyd und Wasser, wird durch die nah beieinander liegenden Redox Kofaktoren ermöglicht. NAD(P)H ermöglicht die initiale Reduktion von Flavin mit zwei Elektronen. Anschließend erfolgt die der Elektrontransfer von FMNH2 zum [2Fe-2S]2+ Cluster, was zum FMNH*/[2Fe-2S]+ Zustand führt. Das reduzierte CntB ermöglicht nun die Elektronen Übertragung auf CntA. Durch Single-turnover Experimente konnten die Zustände FMN/[2Fe-2S]2+ für CntB und [2Fe-2S]+/[Fe]2+ für CntA nach der Übertragung bestimmt werden. Molekularer Sauerstoff kann durch den Transfer von zwei Elektronen von CntA aktiviert werden und führt zum [2Fe-2S]2+/[Fe]3+ Redox Zustand.
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