Investigation of human cytomegalovirus infection in endothelial cells in an advanced 3D co-culture model
The human cytomegalovirus (hCMV) is a common virus infecting individuals all over the world. People who suffer from a weak immune system are often affected by infection, which can lead to a wide variety of organ or systemic disorders and can also cause complications associated with the vascular system.
Endothelial cells represent the inner line of blood and lymph vessel system and can be efficiently infected by hCMV. Infected endothelial cells show an impairment of cellular functionality and thereby destroy the integrity of the vascular system in vivo. In this study, a conditionally immortalized endothelial cell line (HuARLT) was used to investigate the cellular consequences upon hCMV-infection. For this purpose, an advanced 3D cell culture model consisting of uninfected and hCMV-infected cells was established to provide a more in vivo like experimental situation.
In conventional 2D and in 3D culture conditions, uninfected HuARLT cells reflected normal endothelial specific features like migration, tube formation, aggregation and sprouting. On the contrary, HuARLT cells infected with hCMV showed a strong loss of endothelium characteristics. Infected cells were not able to migrate, proliferate and form tubular structures in 2D condition, as well spheroid formation was strongly diminished on 3D level. Interestingly, non-infected HuARLT cells in the infectious neighborhood did not show significant deregulation in 2D functionalities, but revealed an increased outgrowth upon co-cultivation with hCMV-infected cells into the 3D fibrin matrix.
Molecular insights were gained from single cell transcriptome analysis (scRNA seq) of 3D co-cultures of infected cells and non-infected cells. Infected HuARLT cells showed a strong decrease of different regulatory pathways like cellular division or innate immune response as well as specific pathways like angiogenesis and cell-cell adhesion. In contrast, non-infected HuARLT cells revealed the induction of endothelial cell specific gene regulatory pathways like vasculature development and angiogenesis. By this, the restrictions of gene expression in infected cells and the increase of specific gene expression in non-infected cells confirmed the previously observed outcome on the functional level. At the same time, an increased expression of downstream targets of type I interferon (ISGs) was observed. To investigate if the increased expression of endothelial cell specific genes was connected to type I interferon (IFN) signaling, a knockout of the type I IFN receptor was established by CRISPR/Cas9. Co-cultures of knockout cells with infected cells did not show an ISG induction which was presumably accompanied with an impaired expression level of endothelial specific markers. Indicating that the activation of IFN downstream signaling and subsequent induction of ISGs is associated with an enhancement of endothelial specific features, a continuous exposure to infected cells might trigger the specific cell features in non-infected cells. In this study, the scRNA seq suggests a pro-thrombotic phenotype that was observed within the non-infected wildtype bystander population in the infectious milieu, but was absent in knockout bystander cells. This might imply that infection results in endothelial dysfunction which further contributes to vascular disorders. In the end, the study validated the in vitro 3D hCMV-infection model and suggests a so far unknown link between the interferon signaling and the increase of endothelial cell features. Additionally, the hCMV-infection model confirmed what was seen before on either functional level as well as in vivo.
Das humane Zytomegalievirus (hCMV) ist ein weit verbreitetes Virus das Menschen auf der ganzen Welt infiziert. Besonders Menschen mit einem geschwächten Immunsystem sind durch die Infektionen, die systemische Erkrankungen oder Organstörungen verursachen können, gefährdet. Diese Erkrankungen lösen oftmals Komplikationen aus die sich auf das vaskuläre System ausbreiten können.
Endothelzellen bilden die innerste Schicht des Blut- und Lymphgefäßsystems und können effizient durch das hCMV infiziert werden. Infizierte Endothelzellen weisen Beeinträchtigungen der Zellfunktionen auf, welche die Integrität des vaskulären Systems im lebenden Organismus schädigen können. In dieser Studie wurde eine konditional immortalisierte Endothelzelllinie (HuARLT) verwendet um die zellulären Auswirkungen nach einer hCMV-Infektion zu untersuchen. Hierfür wurde ein 3D Zellkulturmodel, bestehend aus hCMV-infizierten und nicht-infizierten Zellen, entwickelt, um die im lebenden Organismus ablaufende Infektion darzustellen.
In standardisierten 2D und in 3D Kulturbedingungen spiegelten nicht-infizierte HuARLT-Zellen endothelspezifische Eigenschaften wie Migration, Ausbildung schlauchförmiger Strukturen oder das Aggregieren und Sprießen in matrixbasierten Systemen wieder. Hingegen zeigen hCMV-infizierte HuARLT Zellen den Verlust dieser für das Endothel charakteristischen Eigenschaften. Infizierte Zellen sind nicht in der Lage zu migrieren, sich zu vermehren oder jegliche Zell-Zellkontakte in 2D oder 3D Kultur auszubilden. Interessanterweise zeigten nicht-infizierte HuARLT Zellen in Kokultur mit infizierten Zellen im Vergleich zu Kontroll-Kokulturen ein verbessertes Sprießen in die 3D Fibrinmatrix. In 2D wurden jedoch keine signifikanten Veränderungen, wie beispielsweise Proliferation oder Migration, beobachtet.
Durch Einzelzellsequenzierung konnten molekulare Einblicke der Zellen nach 3D Ko-kultivierung erlangt werden. Infizierte HuARLT Zellen zeigten massiv verringerte Ausübung regulatorischer Prozesse, wie die Zellteilung oder die angeborene Immunantwort, aber auch spezifischere Prozesse wie Angiogenese und der Zell-Zell-Adhäsion. Im Gegensatz dazu zeigten die nicht-infizierten Zellen in Ko-kultur eine Aktivierung endothelzellspezifischer Mechanismen wie die Gefäßsystementwicklung und Angiogenese. Die Einschränkungen der Genexpression in infizierten Zellen und die gesteigerte Expression spezifischer Gene in nicht-infizierten Zellen bestätigen somit die zuvor beobachteten Ergebnisse. Gleichzeitig stieg die Genexpression von Typ I Interferon (IFN) induzierten Genen (ISGs) an. Durch die Annahme das der Typ I IFN angeschaltete Signalweg und die resultierende ISG-Aktivierung zur Verbesserung der endothelialen Eigenschaften beiträgt, könnte man darauf schließen, dass die dauerhafte Exposition infizierter Zellen auf nicht-infizierte Zellen zur Steigerung der Endothelfunktion in Letzteren führt. Um zu überprüfen ob die gesteigerte Expression endothelspezifischer Gene mit dem IFN aktivierten Signaltransduktionsweg verknüpft ist, wurde ein durch CRISPR/Cas9 vermittelter Knockout im Typ I IFN Rezeptor durchgeführt. In den Ko-kulturen der Knockout-Zellen mit infizierten Zellen wurde die ISG-Expression in den Knockout-Zellen nicht angeschaltet, was vermutlich der Grund für die geschwächte Expression endothelspezifischer Gene war. In dieser Studie wurde zusätzlich das verstärkte Exprimieren thromboseassoziierter Gene in nicht-infizierten Wildtyp-Nachbarzellen beobachtet, was jedoch in den Knockout-Zellen ausblieb. Dies könnte darauf hinweisen, dass eine erhöhte und dauerhafte Signaltransduktion durch Interferon zur Störung des Endothels führen und die Entwicklung von Gefäßerkrankungen fördern kann.
Zusammenfassend wurde gezeigt, dass das 3D hCMV-Infektionsmodel validiert werden konnte und eine bis heute noch unbekannte Verbindung zwischen der Interferonsignalkaskade und der Endothelfunktionssteigerung besteht. Weiterhin konnte das hCMV-Infektionsmodel die Beobachtungen auf funktionaler Ebene als auch im Lebendmodel bestätigen.
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