C-di-GMP signaling and downstream effectors in Pseudomonas aeruginosa

Bense, Sarina

doi:10.24355/dbbs.084-202202041311-0

Published

C-di-GMP signaling and downstream effectors in Pseudomonas aeruginosa

English
German

The universal, bacterial second messenger c-di-GMP is the major initiator of the lifestyle decision between a motile, planktonic and a sessile, biofilm-associated lifestyle. It binds to a broad range of effectors controlling multiple functions, including transcriptional and post-transcriptional processes, as well as direct phenotypic adaptation. Whereas the mechanisms of c-di-GMP synthesis and degradation have been unraveled in detail, the complex downstream signaling of c-di-GMP is not yet fully understood. Although much progress has been made in recent years in identifying novel c-di-GMP effectors, the specific translation of elevated c-di-GMP levels into a cellular response is often largely incomplete. This study aimed at a deeper understanding of the downstream mechanisms of c-di-GMP signaling.
In this context, we analyzed the effects of an increasing c-di-GMP concentration on gene expression and protein production as well as the phenotypic consequences. C-di-GMP production was induced by the ectopically expressed and genetically modified diguanylate cyclase PleD* under growth conditions that are normally characterized by a low c-di-GMP level. Our results show that increasing levels of c-di-GMP cause a switch to a non-motile, auto-aggregative phenotype. The phenotypic adaptation occurs before a c-di-GMP-dependent effect on transcription, translation, or protein abundance was observed. These results suggest that the initial response of P. aeruginosa to increasing c-di-GMP levels is mediated by changes in protein activity of c-di-GMP effectors and not by altered gene expression or protein production.
Furthermore, we characterized the FlgZ-mediated downregulation of motility more deeply by examining the spatiotemporal activity of FlgZ. FlgZ is a high-affinity c-di-GMP binding protein involved in the downregulation of motility by interaction with the stator component MotC. We demonstrated that FlgZ-mediated downregulation of motility is fine-tuned via three independent mechanisms: i) flgZ is transcribed independently from flgMN in stationary growth phase to increase FlgZ protein levels in the cell, ii) FlgZ localizes to the cell pole upon c-di-GMP binding and iii) FimV, a cell pole anchor protein, is involved in increasing the polar localized c-di-GMP-bound FlgZ to inhibit both, swimming and swarming motility. Our results suggest that both proteins are part of a polar macromolecular complex involved in the interaction of FlgZ with the stator protein MotC to repress flagella function.
Taken together, this thesis contributes to our understanding of c-di-GMP downstream signaling. An increase in cytoplasmic c-di-GMP concentration leads to an altered activity of c-di-GMP effectors that respond initially and rapidly to the changing global c-di-GMP pool. The formation of a multiprotein complex that downregulates motility represents a local c-di-GMP signaling mechanism.

Der universelle, bakterielle sekundäre Botenstoff c-di-GMP spielt eine Schlüsselrolle bei dem Umwelt-getriebenen Übergang von einer motilen, planktonischen in eine sessile, Biofilm-assoziierte Lebensform. Er bindet an ein breites Spektrum von Effektoren, die verschiedene Funktionen steuern, darunter transkriptionelle und post-transkriptionelle Prozesse sowie die direkte phänotypische Anpassung. Während die c-di-GMP Synthese und der Abbau detailliert untersucht sind, ist die nachfolgende Signalübertragung noch nicht vollständig geklärt. Obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte hinsichtlich der Identifizierung neuer c-di-GMP Effektoren erreicht wurden, bleibt die gezielte Umsetzung einer ansteigenden c-di-GMP Konzentration in eine zelluläre Antwort oft unvollständig. Ziel dieser Arbeit ist es, ein tiefer gehendes Verständnis der nachfolgenden Mechanismen der c-di-GMP Signalübertragung zu erlangen. In diesem Zusammenhang haben wir die Effekte einer steigenden c-di-GMP Konzentration auf die Genexpression, die Proteinproduktion und die phänotypischen Auswirkungen untersucht. Die c-di-GMP Synthese wurde durch die ektopische Expression der genetisch modifizierten Diguanylat-Zyklase PleD* unter Wachstumsbedingungen, die normalerweise durch einen niedrigen c-di-GMP Spiegel gekennzeichnet sind, induziert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass steigende c-di-GMP Konzentrationen einen Übergang zu einem nicht-motilen, klumpigen Phänotyp verursachen. Die phänotypische Anpassung tritt auf, bevor es zu einem c-di-GMP abhängigen Effekt auf die Transkription, Translation oder den Proteingehalt kommt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die erste Reaktion von P. aeruginosa auf einen Anstieg der c-di-GMP Konzentration durch Veränderungen der Aktivität von c-di-GMP Effektoren und nicht durch veränderte Genexpression oder Proteinproduktion erfolgt. Darüber hinaus haben wir die FlgZ-vermittelte Herabregulierung der Motilität genauer untersucht, indem wir die räumlich-zeitlich aufgelöste Aktivität von FlgZ analysiert haben. FlgZ ist ein hoch-affines c-di-GMP Bindeprotein, das durch Interaktion mit dem Statorprotein MotC die Motilität herabreguliert. Wir konnten zeigen, dass die FlgZ-vermittelte Herabregulation der Motilität über drei voneinander unabhängige Mechanismen justiert wird: 1. flgZ wird unabhängig von flgMN in der stationären Wachstumsphase transkribiert, was den Proteingehalt erhöht, 2. FlgZ lokalisiert am Zellpol, nachdem es c-di-GMP gebunden hat und 3. FimV, ein polares Ankerprotein, erhöht den Gehalt an polar-lokalisiertem, c-di-GMP-gebundenem FlgZ und verringert die Schwimm- und Schwärmmotilität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Proteine Teil eines makromolekularen Komplexes sind, der über Interaktion mit dem Statorprotein MotC die Funktion der Flagelle unterbindet.
Insgesamt trägt diese Arbeit zu unserem Verständnis der nachfolgenden c-di-GMP- Signalübertragung bei. Ein Anstieg der zytoplasmatischen c-di-GMP-Konzentration führt zu einer veränderten Aktivität von c-di-GMP-Effektoren, die unmittelbar und schnell auf den sich verändernden globalen c-di-GMP-Pool reagieren. Die Bildung eines Multiproteinkomplexes, der die Motilität herunterreguliert, stellt einen lokalen c-di-GMP Signalmechanismus dar.