Light-dependent regulation of photosynthesis genes in Dinoroseobacter shibae

Becker, Miriam

doi:10.24355/dbbs.084-202111160934-0

Published

Light-dependent regulation of photosynthesis genes in Dinoroseobacter shibae

English
German

The potential LOV histidine kinase Dshi_1135 was found in a high-throughput screening of the D. shibae transposon mutant library for identification of unknow regulators of photosynthesis genes in the marine model bacterium D. shibae. First experiments indicated a role in the light-dependent regulation of these genes. This study focused on the biochemical characterization of Dshi_1135 and on its role in light-dependent regulation of photosynthesis genes. Furthermore, the function of the transcription regulator PpsR in photosynthesis gene expression was investigated.

Soluble Dshi_1135 was recombinantly produced using a thioredoxin tag and the E. coli Lemo21(DE3) expression strain. Purification of the Dshi_1135 protein was performed by affinity chromatography using Strep Tactin^® Superflow matrix. UV/Vis spectroscopy revealed that Dshi_1135 possesses a FMN cofactor. Dshi_1135 covalently binds FMN under blue light conditions but loses it in the dark. A reversible photocycle was observed for Dshi_1135 and a photoactive cysteine residue at position 61 was identified by site-directed mutagenesis. Phosphotransfer experiments showed an autophosphorylation of Dshi_1135 upon blue light irradiation. It was therefore clearly proven that Dshi_1135 is a blue-light activated LOV protein.

Analyses of a bchF-lacZ reporter gene fusion revealed, that the expression of photosynthesis gene cluster is induced under dark conditions, but not under light and blue light conditions. All collected data regarding the role of Dshi_1135 in regulation of photosynthesis genes indicate, that this protein acts as a blue light sensor but is active under dark conditions, which would be rare exception among the LOV proteins studied to date. Finally, PpsR was shown to be a strong repressor of bchF expression under blue and white light and also slightly in the dark. Additionally, the palindromic sequence TGT-N₁₂-ACA was identified as the respective PpsR binding motif.

Overall, the LOV domain protein Dshi_1135 was identified and functionally characterized as a novel blue-light sensor and regulator of photosynthesis gene expression in the marine model bacterium D. shibae.

Die potentielle LOV Histidinkinase Dshi_1135 wurde in einem Hochdurchsatz-Screening der D. shibae Transposonmutantenbank gefunden für die Identifizierung von bisher unbekannten Regulatoren von Photosynthese-Genen in dem marinen Modellorganismus D. shibae. Erste Experimente deuteten auf eine lichtabhängige Regulation dieser Gene hin. Diese Arbeit fokussierte sich auf die biochemische Charakterisierung von Dshi_1135 und dessen Rolle bei der lichtabhängigen Regulation der Photosynthese-Gene. Weiterhin wurde die Funktion des Transkriptionsfaktors PpsR bei der Expression der Photosynthese-Gene untersucht.

Das lösliche Dshi_1135 Protein wurde mithilfe eines Thioredoxin-Tags rekombinant in dem Expressionsstamm E. coli Lemo21(DE3) produziert. Die anschließende Reinigung des Dshi_1135 Proteins erfolgte über eine Affinitätschromatographie mittles Strep Tactin^® Superflow Säulenmaterial. Über UV/Vis Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass Dshi_1135 einen FMN-Kofaktor besitzt. Dieser bindet unter Blaulichtbedingungen kovalent an das Dshi_1135 Protein, jedoch nicht unter Dunkelbedingungen. Dshi_1135 ist in der Lage einen Photozyklus zu durchlaufen und durch eine ortsspezifische Mutagenese konnte das photoaktive Cystein an Aminosäureposition 61 bestimmt werden. Durch Phosphotranser Experimente konnte die Autophosphorylierung von Dshi_1135 gezeigt werden. Somit wurde klar bestätigt, dass es sich bei Dshi_1135 um blaulicht-aktiviertes LOV Protein handelt. Die Untersuchungen der bchF-lacZ Reportergenfusion zeigten, dass die Expression des Photosynthese-Genclusters in Dunkelheit induziert wird, jedoch nicht und Licht- und Blaulichtbedingungen. Alle generierten Daten hinsichtlich der Rolle von Dshi_1135 in der Regulation von Photosynthese-Genen deuten darauf hin, dass es sich um einen Blaulichtsensor handelt, der jedoch unter Dunkelbedingungen aktiv ist. Dies würde eine seltene Ausnahme in der Familie der bisher untersuchten LOV Photorezeptoren darstellen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass PpsR als Repressor agiert und die bchF-Expression unter Licht- und Blaulichteinfluss stark und unter Dunkelbedingungen leicht reprimiert. Zusätzlich wurde die Palindromische Sequenz TGT-N₁₂-ACA als das Bindemotiv für PpsR identifiziert.

Zusammenfassend wurde das LOV Protein Dshi_1135 funktional charakterisiert als neuer Blaulichtsensor und Regulator der Photosynthese-Gene in dem marinen Modellorganismus D. shibae.