Multiple molecular adaptation strategies of Clostridioides difficile to respond to various stresses in the gut environment during infection
C. difficile is a human pathogen of the gastrointestinal tract and the leading cause of severe nosocomial diarrhea and pseudomembranous colitis. During infection, this strictly anaerobic and spore-forming pathogen is exposed to varying osmolarities, oxygen concentrations and iron availability. In the present study, the adaptative responses to high salinity conditions and the regulatory network of the peroxide sensor PerR were characterized.
Bioinformatic mining via structural comparisons of C. difficile transport systems with known osmolyte transporters identified two proteins: the annotated OpuC (CDIF630erm_01020/01021) and the unknown transporter system "UtS" (CDIF630erm_03509/03510). The substrate spectrum of the OpuC-transporter was determined in a heterologous B. subtilis system and included the compatible solutes carnitine, glycinebetaine, choline, gamma-butyrobetaine, homobetaine, prolinebetaine, crotonobetaine, ectoine, and dimethylsulfoniopropionate (DMSP). Contrary the UtS showed no transport capacities. Investigations on osmotic stress tolerance showed significantly reduced growth of the wild type at a concentration of 350 mM NaCl, whereas growth of the opuCC mutant was almost abolished. Addition of carnitine, glycinebetaine, gamma-butyrobetaine, crotonobetaine, homobetaine, prolinebetaine, and DMSP restored the growth of the wild type but not that of the mutant. Choline did not appear to display any osmo-protective function. Interestingly, the commonly rod-shaped organism switched to a coccoid cell shape under salt stress and reverted to its natural morphology in the presence of carnitine. In addition, salt stress resulted in decreased toxin A concentrations as well as diminished levels of fermentation products. While toxin concentrations were only partially restored by carnitine, the metabolic fingerprint of the wild type was almost entirely recovered, but not the metabolic profile of the mutant.
The H2O2-independent perR regulation was defined using a systems biology approach. Here, the perR mutant displayed a significant growth deficit in the stationary phase. Moreover, perR regulated pathways correlated highly with the Fur-dependent regulation. This observation, in combination with a potential Fur binding site upstream of the perR-operon and the upregulation of Fur in the absence of perR, suggest a co-regulation of Fur and perR.
C. difficile ist ein humanpathogener Erreger des Gastrointestinaltrakts und die Hauptursache für schwere Diarrhöe und pseudomembranöse Kolitis. Während der Infektion ist dieser streng anaerobe und sporenbildende Erreger schwankenden Osmolaritäten, Sauerstoffkonzentrationen und Eisenverfügbarkeiten ausgesetzt. In dieser Arbeit wurden die adaptiven Reaktionen auf Bedingungen mit hohem Salzgehalt und das regulatorische Netzwerk des Peroxidsensors PerR charakterisiert.
Durch bioinformatische Strukturvergleiche von C. difficile-Transportsystemen mit bekannten Osmolyt-Transportern wurden zwei Proteine identifiziert: der annotierte OpuC Transporter (CDIF630erm_01020/01021) und das unbekannte Transportsystem "UtS" (CDIF630erm_03509/03510). Das Substratspektrum des OpuC-Transporters wurde in einem heterologen B. subtilis-System bestimmt und umfasste die Solute Carnitin, Glycinbetain, Cholin, gamma-Butyrobetain, Homobetain, Prolinbetain, Crotonobetain, Ectoin und Dimethylsulfoniopropionat (DMSP). Das UtS zeigte keine Transportkapazitäten. Untersuchungen zur osmotischen Stresstoleranz zeigten bei einer Konzentration von 350 mM NaCl ein signifikant reduziertes Wachstum des Wildtyps, während das Wachstum der opuCC-Mutante nahezu aufgehoben war. Die Zugabe von Carnitin, Glycinbetain, gamma-Butyrobetain, Crotonobetain, Homobetain, Prolinbetain und DMSP konnte das Wachstum des Wildtyps wiederherstellen, nicht aber das der Mutante. Cholin wies keine osmo-protektive Funktion auf. Interessanterweise wechselte der sonst stäbchenförmige Organismus unter Salzstress in eine kokkoide Zellform und kehrte in Gegenwart von Carnitin zu seiner natürlichen Morphologie zurück. Außerdem führte Salzstress zu verminderten Toxin A-Konzentrationen sowie verminderter Mengen von Fermentationsprodukten. Während die Toxin-Konzentrationen durch Carnitin nur teilweise wieder erhöht werden konnten, wurde der metabolische Fingerabdruck des Wildtyps fast vollständig wiederhergestellt, nicht aber das metabolische Profil der Mutante.
Die H2O2-unabhängige PerR-Regulation wurde in einem systembiologischen Ansatz untersucht. Hier wies die perR-Mutante ein signifikantes Wachstumsdefizit in der Stationärphase auf. Zudem korrelierten PerR-regulierte Stoffwechselwege stark mit der Fur-abhängigen Regulation. Diese Beobachtung in Kombination mit einer potenziellen Fur-Bindestelle stromaufwärts des PerR-Operons und der Hochregulierung von Fur in Abwesenheit von PerR legen eine Co-Regulation von Fur und PerR nahe.
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