Towards structure elucidation of the Proline Reductase Complex from Clostridioides difficile
Clostridioides difficile represents the most common cause of antibiotic-induced diarrhea. This work addresses the structural basis of the proline reductase complex. This central enzyme performs important roles in metabolic regulation. Proline reductase consists of three subunits, PrdAβ and PrdAα, which arise from the PrdA protein by selenocysteinolysis, and the selenocysteine-containing PrdB. The complex has a high molecular weight and is membrane-associated. Biophysical and structural biology experiments allowed the proline reductase to be described as a metastable, triacontameric complex with a size of 930 kDa and a high intrinsic flexibility. Limited proteolysis reveals that the N-terminus of PrdAβ is responsible for pentamerization of hexamers. Recombinant isolation methods allowed investigation with cryo-electron microscopy, which may lead to a high-resolution structure of the truncated hexameric subcomplex in the future.
Another focus of this work was on two phospholipases, PlaA and PlaB from Legionella pneumophila. These enzymes attack the biomembranes of host cells, altering their integrity and releasing toxic messengers. The bacterium protects itself from toxicity with regulations of phospholipases. The protein structure of PlaA was determined by X-ray crystallography, providing detailed structural information on regulation.
Another principle of regulation to protect against self-induced lysis was revealed by characterization of the virulence factor PlaB. The tetrameric structure was determined by an anomalous dispersion experiment. Structure-based mutants were characterized and subcellularly localized. These data suggest that PlaB is inhibited intracellularly by a novel mechanism of NAD(H)-mediated tetramerization. After secretion, PlaB is activated by deoligomerization. The structure revealed why the C-terminus of PlaB is essential for enzymatic activity and how novel structural elements enable membrane association of active PlaB dimers.
Clostridioides difficile stellt die häufigste Ursache für antibiotikainduzierte Diarrhöen dar. Diese Arbeit befasst sich mit den strukturellen Grundlagen des Prolinreduktase Komplexes. Dieses zentrale Enzym übernimmt wichtige Rollen in der Stoffwechselregulation. Die Prolinreduktase besteht aus drei Untereinheiten, PrdAβ und PrdAα, die durch eine Selenocysteinolyse aus dem PrdA-Proprotein hervorgehen, und dem Selenocystein enthaltenden PrdB. Der Komplex weist ein hohes Molekulargewicht auf und ist membranassoziiert. Biophysikalische und strukturbiologische Versuche erlaubten es, die Prolinreduktase als einen metastabilen, triakontameren Komplex mit einer Größe von 930 kDa und einem hoher intrinsischer Flexibilität zu beschreiben. Eine limitierte Proteolyse zeigt, dass der N-Terminus von PrdAβ für die Pentamerisierung von Hexameren verantwortlich ist. Rekombinante Isolationsverfahren ermöglichten die Untersuchung mit Kryo-Elektronenmikroskopie, die künftig zu einer hochauflösenden Struktur des verkürzten, hexameren Subkomplexes führen können.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf zwei Phospholipasen, PlaA und PlaB aus Legionella pneumophila. Diese Enzyme greifen die Biomembranen von Wirtszellen an, verändern deren Integrität und setzen toxische Botenstoffe frei. Das Bakterium schützt sich selbst vor der Toxizität mit Regulationen der Phospholipasen. Die Proteinstruktur von PlaA wurde durch Röntgenkristallographie bestimmt, wodurch detaillierte strukturelle Informationen zur Regulation erhalten wurden.
Ein weiteres Prinzip der Regulation zum Schutz vor selbstverursachter Lyse wurde durch die Charakterisierung des Virulenzfaktors PlaB aufgedeckt. Die tetramerische Struktur wurde durch ein anomales Dispersionsexperiment bestimmt. Strukturbasierte Mutanten wurden charakterisiert und subzellulär lokalisiert. Diese Daten legen nahe, dass PlaB intra-zellulär durch einen neuartigen Mechanismus der NAD(H)-vermittelten Tetramerisierung inhibiert wird. Nach Sekretion wird PlaB durch Deoligomerisierung aktiviert. Die Struktur zeigte, warum der C-Terminus von PlaB für die enzymatische Aktivität essentiell ist und wie neuartige Strukturelemente die Membranassoziation von aktiven PlaB-Dimeren ermöglichen.
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