High-ordered protein complexes for bacterial respiration and motility

Müller, Katrin

doi:10.24355/dbbs.084-202104291543-0

Published

High-ordered protein complexes for bacterial respiration and motility

English
German

Stable and transient protein-protein interactions are essential for cellular function. They provide via the multifunctionality of dynamic protein complexes the molecular basis for efficient energy generation, the safe transport of sensible compounds, cellular mobility, and complex regulatory process. In the framework of this dissertation first the dynamics of the protein networks involved in the aerobic and anaerobic respiratory energy generation of the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa were investigated using affinity chromatography and mass spectrometry-based interactomics. In this context the protein interaction networks of subunits of NADH dehydrogenase I (NuoJ), periplasmic nitrate reductase (NapA) and formate dehydrogenase (FdhE) were compared for aerobic and aerobic to anaerobic shift conditions. Moreover, protein interactions of the corresponding, previously elucidated anaerobic protein network for energy generation were quantified using a bacterial two-hybrid system. Overall, a complex rearrangement of protein-protein interactions during the shift from aerobic to anaerobic growth was observed. Surprisingly, major components (NirS, NorCB, NirQ) of anaerobic energy generation via denitrification were still present under aerobic conditions and served as molecular platform for protein complex assembly. In a second project the protein composition and size of extracellular membrane vesicles from P. aeruginosa derived from wildtype, gene mutants and overproduction strains of the membrane-structuring proteins LemA1 and LemA2 were determined. Observed clear out differences in the morphology, the protein patterns, and diameters between isolated vesicles pointed towards the importance of proteins involved in all envelope restructuring, motility, protein transport and stability, cell division, and in the metabolism for vesicle formation and function. Thirdly, an exact protein-protein interaction map at the amino acid level for the complex of the chaperone DnaK and the flagellin protein FliC was determined using a SPOT membrane approach. The DnaK/FliC complex was found in the periplasm and outside the cell attached to the flagellum using electron microscopy. An ATP-independent DnaK function was observed.
Overall, important dynamic protein networks involved in the energy metabolism, vesicle formation and flagellum formation of the pathogenic bacterium P. aeruginosa were solved and fostered the understanding of its infectious life style.

Stabile und transiente Protein-Protein-Interaktionen sind essentiell für die zelluläre Funktion. Sie bilden über die Multifunktionalität dynamischer Proteinkomplexe die molekulare Grundlage für eine effiziente Energiegewinnung, den sicheren Transport sensibler Verbindungen, die zelluläre Beweglichkeit und komplexe regulatorische Prozesse. Im Rahmen dieser Dissertation wurde zunächst die Dynamik der an der aeroben und anaeroben respiratorischen Energiegewinnung beteiligten Proteinnetzwerke von Pseudomonas aeruginosa mittels Affinitätschromatographie, gekoppelt mit LC/MS-MS untersucht. In diesem Zusammenhang wurden die Proteininteraktionsnetzwerke durch die Untereinheiten der NADH-Dehydrogenase I (NuoJ), der periplasmatischen Nitratreduktase (NapA) und der Formiatdehydrogenase (FdhE) für aerobe und aerobe zu anaeroben shift-Bedingungen verglichen. Zudem wurden die Proteininteraktionen des zuvor aufgeklärten anaeroben Proteinnetzwerks zur Energiegewinnung mittels eines bakteriellen Two-Hybrid-Systems quantifiziert. Eine komplexe Umordnung von Protein-Protein-Interaktionen während des shifts von aerobem zu anaerobem Wachstum wurde beobachtet. Die Hauptkomponenten (NirS, NorCB, NirQ) der anaeroben Energiegewinnung (Denitrifikation) waren auch unter aeroben Bedingungen vorhanden und dienten als molekulare Plattform für die Proteinkomplexbildung. In dem zweiten Projekt wurde die Proteinzusammensetzung und Größe von extrazellulären Membranvesikeln von P. aeruginosa, aus Wildtyp, Genmutanten und Überproduktionsstämmen der Membranstrukturproteine LemA1 und LemA2 bestimmt. Deutliche Unterschiede in der Morphologie, den Proteinmustern und dem Durchmesser zwischen den isolierten Vesikeln wiesen auf die Bedeutung der Proteine hin. Diese sind an der Umstrukturierung der Hülle, der Motilität, dem Proteintransport und -stabilität, der Zellteilung und am Metabolismus der Vesikelbildung und -funktion beteiligt. Drittens wurde eine exakte Protein-Interaktionskarte auf Aminosäure-Ebene zwischen dem Chaperon DnaK und dem Flagellin-Protein FliC mittels der SPOT-Technik bestimmt. Der DnaK/FliC-Komplex wurde im Periplasma und außerhalb der Zelle an der Geißel mittels Elektronenmikroskopie gefunden, eine ATP-unabhängige DnaK-Funktion wurde beobachtet.
Insgesamt wurden wichtige dynamische Proteinnetzwerke aufgeklärt, die am Energiestoffwechsel, der Vesikelbildung und der Geißelbildung von P. aeruginosa beteiligt sind und das Verständnis seiner infektiösen Lebensweise fördern.