Struktur-basiertes Protein Engineering von neuen Penicillin G Acylasen aus Gram-positiven Bakterien für innovative biotechnologische Anwendungen

Mayer, Janine

doi:10.24355/dbbs.084-202103021544-0

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Struktur-basiertes Protein Engineering von neuen Penicillin G Acylasen aus Gram-positiven Bakterien für innovative biotechnologische Anwendungen

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Penicillin G Acylasen (PGAs) sind Schlüsselenzyme für die biotechnologische Herstellung von semi-synthetischen ß-Lactam-Antibiotika. Neben der industriell verwendeten, aber wenig thermostabilen PGA aus E. coli wurden in dieser Arbeit neuartige PGAs aus Bacillus spp. durch Datenbanksuche identifiziert. Diese wurden mit B. megaterium erfolgreich produziert, sekretiert und experimentell als aktive PGAs bestätigt. Zwei neuartige PGAs aus B. thermotolerans (BtPGA) und B. sp. FJAT-27231 (FJAT-PGA) wiesen mit 64,5 und 73,3 °C um bis zu 16,5 °C gesteigerte Thermostabilitäten gegenüber der PGA aus B. megaterium (BmPGA) auf.
Die Proteinstrukturen der heterodimeren Bm-, Bt- und FJAT-PGA wurden als erste Strukturen von PGAs aus Gram-positiven Bakterien aufgeklärt. Auf dieser Grundlage wurden Hybrid-PGAs, die aus Untereinheiten verschiedener Spezies bestehen, und Single-chain PGAs, bei denen die beiden Untereinheiten durch einen artifiziellen Linker kovalent verbunden wurden, erfolgreich produziert, gereinigt und deren Aktivität bestätigt. Die Thermostabilität einer Single-chain PGA erhöhte sich im Vergleich zur FJAT-PGA um weitere 3,7 °C, während die Schmelzpunkte der Hybrid-PGAs zwischen denen der ursprünglichen Varianten lagen, ohne erkennbaren Einfluss der einzelnen Untereinheiten.
Weiterhin wurden die Bm-, Bt- und FJAT-PGA als quervernetzte Enzymkristalle (CLECs) immobilisiert, um die Prozessstabilität zu erhöhen und eine Wiederverwendbarkeit zu ermöglichen. Die Untersuchung der mechanischen Stabilität der CLECs zeigte, dass die FJAT-PGA-CLECs unter den untersuchten PGA-CLECs am stabilsten und gleichzeitig noch aktiv waren. Um größere Mengen an CLECs herstellen zu können, wurde außerdem die Kristallisierbarkeit der FJAT-PGA durch Reduktion der Oberflächenentropie verbessert. Dabei wurden neun flexible Aminosäurereste auf der Enzym-Oberfläche durch Alanin ersetzt. Bei diesen Varianten entstanden bereits nach wenigen Minuten Kristalle.
Im letzten Teil dieser Arbeit konnte außerdem die Sekretion einer weiteren PGA aus B. massiliogorillae durch Screening einer plasmidbasierten Signalpeptid-Bibliothek verbessert und so erstmalig eine Reinigung und Charakterisierung dieser PGA ermöglicht werden.
Zusammengefasst bilden die in dieser Arbeit identifizierten, hochaktiven und thermostabilen PGAs zusammen mit den eingesetzten Protein-Engineering-Experimenten und der Immobilisierung die Grundlage für die Etablierung neuer PGA-basierter biotechnologischer Prozesse.

Penicillin G acylases (PGAs) are key enzymes for the biotechnological production of semi-synthetic ß-lactam antibiotics. In addition to the industrially used, but not very thermostable PGA from E. coli, novel PGAs from Bacillus spp. were identified by database search. These were successfully produced and secreted with B. megaterium and experimentally confirmed as active PGAs. Two novel PGAs from B. thermotolerans (BtPGA) and B. sp. FJAT-27231 (FJAT-PGA) showed with 64.5 and 73.3 °C up to 16.5 °C increased thermostabilities compared to the PGA from B. megaterium (BmPGA).
The protein structures of the three heterodimeric Bm-, Bt- and FJAT-PGA were elucidated as the first structures of PGAs from Gram-positive bacteria. On this basis, hybrid PGAs consisting of subunits of different species and single-chain PGAs, in which the two subunits are covalently linked by an artificial linker, were successfully produced, purified and their activity confirmed. The thermostability of a single-chain PGA increased by a further 3.7 °C compared to FJAT-PGA, while the melting points of the hybrid PGA were between those of the original variants, with no direct influence of the individual subunits.
Furthermore, the BmPGA, BtPGA and FJAT-PGA were immobilized as cross-linked enzyme crystals (CLECs) to increase process stability and allow reusability. The investigation of the mechanical stability of the CLECs showed that the FJAT-PGA-CLECs were most stable among the investigated PGA-CLECs and at the same time still active. In order to produce larger quantities of CLECs, the crystallizability of the FJAT-PGA could be improved by reducing the surface entropy. Nine flexible amino acid residues on the enzyme surface were replaced by alanine. With these variants, crystals could be obtained after only a few minutes.
In the last part of this work, the secretion of another PGA from B. massiliogorillae could be improved by screening of a plasmid-based signal peptide library, allowing purification and characterization of this PGA for the first time.
In summary, the highly active and thermostable PGAs identified in this work, together with the applied protein engineering experiments and immobilization, form the basis for the establishment of new PGA-based biotechnological processes.